[摘要] 目的 探讨深静脉血栓形成患者外周血辅助T细胞亚群17（Th17）及其细胞因子白介素17（IL-17）的变化及临床意义。 方法 选取82例深静脉血栓形成患者，分为急性期29例，亚急性期24例，慢性期29例，另选20例同期门诊体检者中的健康者作为对照组。采用流式细胞术检测外周血Th17细胞的百分率，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血浆中IL-17的表达水平。 结果 深静脉血栓形成患者组外周血Th17细胞百分率及IL-17的表达水平均高于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），不同分期患者组间Th17细胞百分率及IL-17的表达水平比较，差异无统计学意义。 结论 深静脉血栓形成患者外周血Th17细胞活性增高，Th17细胞激活可能与深静脉血栓形成发病及病程进展密切相关。
[关键词] 深静脉血栓形成；辅助T细胞亚群17；白介素17；炎症；免疫
[中图分类号] R619+.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0009-03
深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是临床常见的周围血管疾病，具有较高的致残及致死率[1]。DVT好发于下肢，严重者可因重度静脉阻塞而致股青肿，甚至发生静脉性坏疽；栓子如果脱落进入肺动脉，可引起肺栓塞，大面积肺栓塞可致命。多数患者晚期遗留慢性深静脉功能不全，严重影响生活质量。目前，许多研究已经证明炎症反应与深静脉血栓形成之间有密切关系[2-3]。辅助T细胞亚群17（Th17）是近年发现的一种新的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等细胞因子，尤其IL-17A具有很强的促炎作用[4]。研究证实，Th17细胞在介导慢性炎症及自身免疫性疾病中发挥着重要作用[5]。但关于其在DVT的发病及病程进展过程中作用的研究报道尚少见。本实验通过研究Th17细胞及其细胞因子在DVT不同发病阶段患者外周血中的变化，来揭示其在DVT的发病及病程进展过程中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2012年9月～2012年12月在山西大医院血管外科住院的DVT患者共82例为患者组，其中，男性43例，女性39例，年龄17～89岁，平均52.6岁。根据其病程进展的不同时期将患者组分为急性期组（病程≤14 d）；亚急性期组（病程15～28 d）；慢性期组（病程≥28 d）。所有选入DVT患者均除外合并有活动性下肢溃疡、新鲜伤口，及严重心、脑、肺疾病，糖尿病及周身其他系统感染者。再选取20例同时期本院体检者中的健康者作为对照组，其中，男性10例，女性10例，年龄23～66岁，平均54.5岁。
1.2 方法
1.2.1 主要设备及试剂
异硫氰基荧光素（FITC）标记的CD4单克隆抗体、藻红蛋白（PE）标记的IL-17A单克隆抗体、藻红蛋白（PE）标记的IL-17A同型对照抗体、细胞刺激剂及固定破膜剂均购于美国BD公司；FACSCalibur型流式细胞仪购于美国BD公司；1640培养液购于HYCLONG公司，胎牛血清购于杭州四季清公司；人外周血淋巴细胞分离液购于天津澋洋生物科技公司；IL-17A的ELISA检测试剂盒购于上海源叶生物科技公司。
1.2.2 人外周血单个核细胞分离
患者及健康对照组均空腹取肘静脉血5 mL于肝素钠抗凝管中，其中2 mL血通过Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。3 mL血2000 r/min离心15 min分离血浆，贮存于-80℃冰箱，用以检测血浆IL-17的表达水平。
1.2.3 流式细胞术检测外周血Th17细胞的百分率
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，后用5 mL PBS液及3 mL含有胎牛血清的1640培养液分别洗涤，加入细胞刺激剂2 μL及含有胎牛血清的1640培养液1 mL，置于37℃，5%CO2温箱中温育5 h。洗涤细胞后加入FITC标记的CD4单抗室温避光反应20 min；再次PBS液洗涤，加入250 μL细胞固定液4℃避光反应20 min；后加入1 mL破膜液（10倍稀释后）1500 r/min离心5 min洗涤，重复此过程一次；加入PE标记的IL-17A的抗体，并设同型对照，4℃避光反应30 min；再次加入1 mL破膜液（10倍稀释后）1500 r/min离心5min洗涤，重复此过程一次；洗涤后将细胞重悬于150 μL PBS液，用流式细胞仪检测。
1.2.4 血浆IL-17的表达水平测定
取上述-80℃冻存血浆，采用ELISA双抗体夹心法检测，具体操作依据试剂盒对应的说明书进行。
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，P < 0.05为差异有统计学意义。Th17细胞百分率结果不服从正态分布，以M±QR描述；IL-17检测结果用x±s表示。
2 结果
2.1 外周血Th17细胞百分率
通过流式细胞术检测结果见表1、2。Th17细胞百分率（IL-17A/CD4+T）DVT患者组为 （7.58±5.88）%；急性期组为（7.32±6.62）%；亚急性组为（7.63±4.42）%；慢性组为（7.58±5.21）%；健康对照组为（2.00±0.18）%。患者组Th17细胞百分率明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；急性期、亚急性期及慢性期三组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.2 IL-17表达水平
ELISA检测结果见表3、4，DVT患者组IL-17表达水平明显高于对照组（P < 0.05），急性期、亚急性期及慢性期三组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
DVT发病机制甚为复杂，现在越来越多的研究表明，DVT的发病与炎症反应关系密切。分子生物学研究表明，炎症与血栓形成同属宿主反应，炎症细胞对血栓形成有着触发和增强的作用，其分泌的促炎物质可使纤维蛋白原沉积，并可抑制纤溶和血栓调节素，使静脉内皮细胞从抗凝状态转化为凝血状态[6]。同时，炎症还可促进血液的高凝状态。在对静脉血栓形成机制研究的过程中，Ferraccioli G等[7]指出，组织学观察血栓形成早期血管壁上有中性粒细胞渗出，随后出现单核细胞和淋巴细胞，血栓形成过程伴随急性炎症向慢性炎症转化的过程。深入研究发现炎症与血栓形成之间存在网络关系[8-9]。炎症反应除直接损伤内皮细胞外，还通过一系列炎症介质介导对组织的损伤[10]。炎症促进高凝状态，而血栓形成中的产物也可引起炎症。一般公认TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10等炎性因子与血栓形成关系较为密切。
Th17细胞是近年来发现的一类新的CD4+T细胞亚群，其生物学特性与传统的Th1、Th2细胞以及调节性T细胞（Treg）有明显不同[11]。Th17细胞在机体内产生途径不同于Th1、Th2细胞，目前认为它是在转化生长因子β（TGF-β）和IL-6、IL-23共同刺激下诱导初始T细胞分化而来的[12]。Th17细胞在机体内的作用机制非常复杂，其分泌的细胞因子中IL-17最具特征性，IL-17是一个细胞因子家族，其中IL-17A即通常所指的IL-17，为最主要的成员，其生物学功能主要是促进中性粒细胞的动员、募集和活化、介导和促进炎症反应[13]。Th17细胞通过产生IL-17与IL-17受体结合发挥功能。机体许多细胞如上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞上均有丰富的IL-17受体（IL-17RA）。已证实，Th17细胞在自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）、炎症性肠病（IBD）等疾病中发挥着重要作用[14-15]。此外，Th17细胞还与SLE、系统性硬皮病、银屑病、过敏性哮喘、特应性皮炎等免疫性及过敏性疾病关系密切[16-17]。但Th17细胞与深静脉血栓形成之间有无关联性尚少见相关报道。
本实验结果显示：DVT患者外周血中Th17细胞百分率及IL-17表达水平均明显增高，提示Th17细胞在DVT的发病过程中可能有一定作用。其具体机制可能是IL-17具有招募和激活炎症细胞从而激活炎症反应的作用，同时IL-17作用于不同的靶细胞，诱导其他细胞因子产生，参与细胞因子网络调节，触发炎症递质释放，从而促进血栓形成。DVT患者不同分组之间检测结果比较无统计学差异，未见一定规律性，提示Th17细胞激活虽参与了DVT由急性期向慢性期转化的整个病程进展过程，但尚不能通过检测Th17细胞及其细胞因子来判断DVT的病情进展及预后。Th17细胞作用机制复杂，其功能活性可随着所在局部环境及其它细胞因子的不同而变化，关于其在DVT不同疾病进展时期中具体作用及调节机制有待进一步研究。
综上所述，Th17细胞可能参与了DVT的发病及病程进展过程，提示拮抗Th17和IL-17可能是治疗DVT新的手段，为DVT 的预防和临床诊治提供了一个新的思路，为药物治疗提供新的靶点。本实验不足之处在于仅对不同分期DVT患者外周血Th17细胞百分率及血浆IL-17进行检测，而关于DVT患者Th17细胞活化及IL-17高表达及其与血栓形成相关的具体机制尚未涉及，还需进一步探讨。
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（收稿日期：2013-02-18 本文编辑：魏玉坡）