摘要[目的]探討复合酶协同超声波提取灵芝流浸膏的最佳工艺条件，以期为灵芝流浸膏的工业化生产提供理论依据。[方法] 以菌草鹿角灵芝为原料，采用灵芝流浸膏的提取和复合酶用量配比、复合酶酶解条件、超声波条件正交试验对复合酶协同超声波技术提取菌草灵芝流浸膏的工艺进行研究，并与传统水浴浸提法进行对比。[结果] 复合酶协同超声技术提取灵芝流浸膏的最佳工艺条件：酶组成为纤维素酶2.0 g，木瓜蛋白酶0.8 g，果胶酶3.0 g；酶解条件为酶解温度60 ℃，pH 5.5，时间80 min；超声条件为时间15 min，功率500 W，温度55 ℃。对照试验结果表明，常规浸提法提取流浸膏得率为2.71%，而复合酶协同超声波法提取流浸膏得率为66.90%，复合酶协同超声波法提取流浸膏的得率约是常规浸提法的25倍。[结论]采用复合酶协同超声波技术，提高了菌草灵芝流浸膏和多糖得率，显著缩短了提取时间，且降低了提取液黏度，为灵芝流浸膏和多糖的提取提供了一种可行的方法。
关键词灵芝；流浸膏； 复合酶；超声波
中图分类号R284.2文献标识码A文章编号0517-6611（2018）28-0151-04
Study on Extraction of Ganoderma lucidum Flow Extract by Complex Enzyme Combined with Ultrasonic Technique
ZHANG Guiqing，LIN Weida，YAO Junxin et al
（Fujian Agricuture and Forestry University China National Engineering Research Center of Juncao Technology，Fuzhou，Fujian 350002 ）
Abstract[Objective]The optimal process conditions of complex enzyme extraction combined with ultrasonic extraction of Ganoderma lucidum extract were discussed in order to provide theoretical basis for the industrial production of Ganoderma lucidum extract. [Method]Using Juncao antlers Ganoderma lucidum as raw materials，the process of using complex enzyme combined with ultrasonic technique to extract Juncao Ganoderma lucidum extraction was studied by extraction of Ganoderma lucidum extract and the Orthogonal test on the ratio of complex enzymes， enzymatic hydrolysis conditions and ultrasonic conditions，and compared with traditional water bath extraction.[Result]The optimal process conditions of complex enzyme combined with ultrasonic technique to extract Juncao Ganoderma lucidum extraction， the enzyme composition was cellulase 2.0 g， papain 0.8 g， pectinase 3.0 g；the enzymolysis conditions were as follows， the temperature was 60 ℃， the pH was 5.5， the time was 80 minutes； ultrasound conditions，time was 15 minutes， power was 500 W， temperature was 55 ℃. The contrast experiment showed that the extract yield of flow extract was 2.71% by using conventional extraction， while that of flow extract was 66.90% by compound enzyme synergistic ultrasonic method，and the extract rate of flow extract by compound enzyme synergistic ultrasonic method was about 25 times of that of flow extract by conventional extraction method. [Conclusion]Synthetic enzyme synergistic ultrasonic technology improves the yield of Juncao Ganoderma lucidum extract and polysaccharide， significantly shortens the extraction time， and reduces the viscosity of the extract.It provides a feasible method for extracting Ganoderma lucidum extract and polysaccharide.
Key wordsGanoderma lucidum；Flow extract；Complex enzyme；Ultrasonic
灵芝是《神农本草经》记载的名符其实的“上上药”，被视为吉祥长寿的象征，享有“仙草”的美誉。而菌草鹿角灵芝比一般灵芝的有效成分高3%，安全性也较高，具有提高免疫力、改善睡眠、抗肿瘤、保肝、辅助治疗关节炎等保健作用。灵芝切碎，按一定工艺参数提取、浓缩、蒸干得到的提取物，呈深黄褐色的膏状物，称为灵芝流浸膏，它的有效成分非常丰富，主要含有多糖类、三萜类、甾醇类、核苷类、氨基酸及微量元素等[1]。灵芝多糖是灵芝的主要功效成分之一，大多为异多糖，主要为葡萄糖，少量为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖等[2]，其中灵芝多糖因其抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和抗衰老等作用倍受人们关注，具有广泛的药理活性，能提高机体免疫力和耐缺氧能力，有消除自由基、抗衰老、抑制肿瘤、降血压、降血脂等作用[3]。现代科学研究表明，灵芝中的三萜类成分也是其主要有效成分之一，具有抗肿瘤、保肝、免疫促进、调血脂和降血糖、抗真菌等多种药理作用[4] 。
关于段木灵芝的研究很多，有大量的文献可查，技术和方法都比较成熟，但是对于菌草灵芝的研究鲜有报道，而现今菌草灵芝凭借其生产成本低、成品质量高等优势，已逐渐在全国推广，成为灵芝研究领域的重要品种。但关于菌草灵芝流浸膏方面的研究还是空白，因此开展菌草灵芝流浸膏生产工艺研究意义重大。
有研究报道，将酶用于中药的提取制备中，效果良好。如纤维素酶、果胶酶等可以破坏细胞壁的致密构造，从而有利于有效成分的溶出[5]。酶解法通过酶解破坏细胞结构来强化有效成分的传质过程，较大幅度提高多糖得率，不易破坏多糖的立体结构和生物活性[6]，而在提取过程中，利用超声波产生强烈的振动、较高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，能加速有效成分进入溶剂，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速有效成分的扩散释放[7]，与常规溶剂提取相比，超声波辅助提取是近年来发展较快的新型提取方法，具有高效性、强选择性、提取时间短、能耗低等特点[8]。为此，笔者采用正交试验设计法优化复合酶并协同超声波提取菌草灵芝流浸膏的最佳工艺条件并同传统方法的提取结果进行了比较，探索各因素对灵芝流浸膏指标性成分含量的影响，以期提高提取效率、缩短提取时间和降低能耗，为改进灵芝流浸膏的生产工艺提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。菌草鹿角灵芝，购于福建农林大学小卖铺。
1.1.2
主要仪器。超离心研磨仪（德国，RetschZM200）；数控超声波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；pH计（雷磁pHS-3C，厦门精艺兴科技有限公司）；磁力搅拌器（IKA-Werke GmbH and Co.KG）；冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；旋转蒸发器RE52CS（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（III）循环水式真空泵（贡义市予华仪器有限责任公司）；数显恒温水浴锅HH-6（国华电器有限公司）。
1.1.3
主要试剂。纖维素酶400 U/mg、木瓜蛋白酶1 000 U/mg、果胶酶500 U/mg、醋酸、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
1.2方法
1.2.1
灵芝流浸膏的提取。菌草鹿角灵芝子实体做成切片，放在烘箱中65 ℃烘干后用超离心研磨仪研磨成菌草鹿角灵芝粉末，过80目筛。称取5.0 g灵芝子实体粉末，加入一定pH的缓冲液（醋酸-醋酸钠缓冲液pH为4.6～5.5，磷酸盐缓冲液pH为6.5）100.0 mL和适量的酶，充分混匀，恒温酶解。反应结束后，将其置于100 ℃水浴中10 min使酶灭活，冷却至室温，提取液经过滤，通过旋转蒸发皿减压浓缩至10 mL左右，冷冻干燥至恒重，计算灵芝流浸膏粉的提取率。
灵芝流浸膏粉提取率=灵芝流浸膏质量 /灵芝粉质量×100%
1.2.2
复合酶用量配比正交试验。在60 min、50 ℃、pH为5的酶解条件下，以纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶的用量为正交试验的3个因素，每个因素各设定4个水平，进行L16（43） 正交试验（表1）。
1.2.3
复合酶酶解条件正交试验。根据最佳复合酶用量配比试验结果，以酶提温度、pH、酶提时间作为考察因素，每个因素各设定3个水平，进行L9（33）正交试验（表2）。
1.2.4
超声波条件正交试验。根据最佳复合酶用量配比试验以及最佳酶解条件试验结果，以超声时间、温度、功率作为考察因素，每个因素各设定3个水平，进行L9（33）正交试验（表3）。
1.2.5
复合酶-超声协同提取法与传统水浴浸提法的比较。为了考察复合酶-超声波协同提取法与传统水浴浸提法对灵芝流浸膏提取率的影响，称取5.0 g灵芝粉8份，其中4份按照复合酶协同超声波提取最佳工艺条件进行提取，另外4份分别加入100 mL浓度40%乙醇水浴浸提80 min，温度60 ℃。
2结果与分析
2.1复合酶用量配比
酶法是一种通过酶解破坏细胞结构来强化有效成分的传质过程，是一种最大限度地提取中药有效成分的方法[9]，目前报道的酶法提取中，酶制剂大多采用纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶[9]，所以笔者选用这3种酶作为复合酶组成成分进行研究，并和不加酶的传统提取方法进行比较。从表4可以直观看出，菌草鹿角灵芝流浸膏的最佳提取工艺为A4B4C3，即纤维素酶（A）2.0 g、木瓜蛋白酶（B）0.8 g，果胶酶（C）3.0 g组合，在60 min、50 ℃、pH 4.6的酶解条件下，灵芝流浸膏的平均提取率为56.81%。极差（R）反映了同一因素取不同水平时K值的变化幅度，为同一因素下不同水平对应的最大值与最小值之差。变化幅度越大，说明该因素对试验结果的影响越大，它就越重要[10]。从纤维素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果胶酶（C）的极差R值分别为17.64、15.84、13.45可以推导出，三者对结果的影响从大到小依次为纤维素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果胶酶（C）。由直观分析数据看，因素A、B、C的G值均大于1.5，即各因素均为主要因素[11]，影响程度依次为A、B、C。但直观分析法不能对误差大小进行估计，也不能知道分析的精度，为了进一步判断试验误差与试验条件是否影响试验结果，将正交试验数据进行方差分析和显著性检验，找出主要因素。从正交试验方差分析结果可知，FA=7.56，FB=5.40，FC=4.90。可见，纤维素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果胶酶（C）对菌草鹿角灵芝流浸膏提取率都有显著影响，纤维素酶（A）、木瓜蛋白酶（B）、果胶酶（C）都为主效因子。
根据正交试验结果推导的最佳组合A4B4C3进行验证试验，重复3次，结果制备的灵芝流浸膏提取率平均值为56.81%，RDP=6.65%，为最大值。
2.2复合酶酶解条件
选取灵芝作为酶法提取的对象，试图
破坏灵芝的细胞壁结构来提高灵芝有效成分提取效率，对于实际应用有着现实的意义。从表5可以直观看出，菌草
鹿角灵芝流浸膏的最佳提取工艺为A3B2C2，即酶解温度（A）为60 ℃，pH（B）5.5，时间（C）80 min。从温度（A）、pH（B）、时间（C）的R值分别为3.01、3.30、11.83可知，时间（C）对结
果的影响最大，温度（A）对结果的影响最小，即因素主次排列顺序为C>B>A。由直观分析数据看，因素A、B的G值均小于1.5，即温度（A）、pH（B）均为次要因素；时间（C）的G值大于1.5，即时间（C）为主要因素。从正交试验方差分析结果可知，温度（A）、pH（B）、时间（C）的FA=0.28，FB=0.27，FC=
2.3超声波条件
超声波辅助提取是利用超声波的空化作用、机械作用、热效应等增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂的穿透力，从而提高中药成分的浸出率，具有省时、节能、提取效率高等优点，值得一提的是它没有因较高温度减弱有机成分的活性[12-13]。该技术具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等特点。从表6可以直观看出，菌草鹿角灵芝流浸膏的提取工艺为A2B3C3，即超声时间（A）为15 min，功率（B）为500 W，温度（C）为55 ℃。由正交表极差（R）分析可知，因素主次排列顺序为C>B>A，即影响因素依次为温度（C）、功率（B）、时间（A）。由直观分析数据看，因素A、B、C的G值均小于1.5，即时间（A）、功率（B）、温度（C）因素均为次要因素。
从正交方差分析结果可知，超声时间（A）、功率（B）、温度（C）F值分别为FA=0.132、FB=0.294、FC=0.554，可见它们对菌草鹿角灵芝流浸膏提取率都没有显著影响，即时间、功率、温度都不是主效因子。
2.4复合酶超声协同提取法与传统水浴浸提法比较结果
采用常规浸提法提取的菌草鹿角灵芝流浸膏得率为2.71%，复合酶协同超声波法提取的菌草鹿角灵芝流浸膏得率为66.90%，复合酶协同超声波法提取的菌草鹿角灵芝流浸膏得率约是常规浸提法的25倍。复合酶-超声波协同提取法提高了灵芝多糖提取率，可能是由于以下原因造成的：超声破碎是利用超声波振动传递能量，改变物质组织结构、状态、功能或加速这些改变过程，从而提高多糖得率，缩短提取时
间，降低提取液黏度；生物酶技术是一种新型高效绿色提取技术，对多糖的破坏较小，操作相对简单且能保证较高的得率，酶解法减少了化学试剂的使用，有利于资源的利用和环境的保护[14]。
3结论与讨论
复合酶协同超声波提取灵芝流浸膏的最佳工艺条件：复合酶组成为纤维素酶2.0 g，木瓜蛋白酶0.8 g，果胶酶3.0 g；酶解条件为酶解温度60 ℃，pH 5.5，时间80 min；超声条件为时间15 min，功率500 W，温度55 ℃。在复合酶协同超声波提取最佳工艺条件下，菌草鹿角灵芝流浸膏得率为66.90%，常规浸提法提取菌草鹿角灵芝流浸膏得率为2.71%，复合酶协同超声波法提取菌草鹿角灵芝流浸膏得率约是常规浸提法的25倍，且显著缩短了提取时间。
中药浸膏粉的吸湿性是长期困扰中药制剂生产的主要问题，药浸膏粉吸潮后变软、结块，流动性变差，给生产和贮藏带来困难并影响中药制剂的质量和疗效。长期以来在中药制剂生产实践中，人们发现中药浸膏的质量与其物理性质有着密切的关系，菌草灵芝膏就是由于流动性较差、吸湿性较强，最终导致重复验证试验很难进行。
另外，该试验菌草鹿角灵芝是在学校小卖铺中购买的，生长时期不同，而不同生长时期的菌草鹿角灵芝切片的流浸膏提取率是不同的，这也导致重复验证试验很难进行。在今后的研究过程中，如果能精心挑选同一生长时期的菌草鹿角灵芝切片进行流浸膏提取，效果一定会更好。
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