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摘要：分别通过单因素试验和Box-Behnken中心组合试验来优化鸡血藤悬浮细胞产异黄酮的培养基组成和培养条件。响应面法分析指出最佳工艺条件为蔗糖39.3 g/L，水解酪蛋白3.95 g/L，培养温度22.7 ℃。在此优选工艺下，鸡血藤悬浮细胞干质量和总异黄酮含量平均值分别为11.65 g/L和5.34 mg/L。总异黄酮含量与预测值5.41 mg/L相差比例仅为2.65%，说明该模型准确有效。响应面法优化大幅度地提高了鸡血藤悬浮细胞产异黄酮含量，为鸡血藤异黄酮的深入开发提供了技术基础。
关键词：鸡血藤；悬浮细胞；异黄酮；Box-Behnken中心组合试验；响应面
中图分类号：R284.2
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）04-0050-03
鸡血藤是豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤茎，主产广西，广东、云南也有分布。鸡血藤是补血、活血的传统大宗中药材，具有促进造血功能、抗炎、抗氧化、免疫调节、镇静催眠等药理作用[1]。此外，现代医学研究还发现鸡血藤具有广谱的抗肿瘤和抗病毒活性[2-3]。药理学研究表明，鸡血藤药理作用的关键活性成分是异黄酮类化合物，主要包括大豆黄酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂异黄酮这4种主要的异黄酮活性成分[1，4]。中药材植物细胞的悬浮培养可以生产异黄酮，如怀槐[5]、野葛[6]、大豆[7]等，但目前尚未有关于鸡血藤悬浮细胞产异黄酮的报道。近年来，鸡血藤野生资源面临枯竭，供需矛盾尖锐，因此开展悬浮细胞产鸡血藤活性成分的研究具有重要意义。本研究采用响应面法优化鸡血藤悬浮细胞的培养基成分，提高异黄酮活性成分的产量，为对鸡血藤药效的深入开发提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为鸡血藤愈伤组织，取自鸡血藤嫩叶部位，通过添加1.0 mg/L 6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、0.5 mg/L NAA（α-萘乙酸）、30 g/L蔗糖、0.1 g/L 维生素C以MS培养基诱导愈伤组织[8]。愈伤组织在（25±1） ℃、暗环境下培养，每15 d继代1次。愈伤组织经过传代筛选获得浅黄色、疏松颗粒状的愈伤组织培养系，准备接种。
1.2 细胞悬浮培养条件
将上述愈伤组织（约为5 g鲜质量/瓶）接入液体MS培养基，其中添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、0.1 g/L、3 g/L水解酪蛋白。细胞置于含100 mL培养基的300 mL 三角烧瓶中进行培养，于（25±1） ℃暗环境下以 100 r/min 的速度摇瓶悬浮培养12 d，每组试验设置3个重复。
1.3 试验设计
1.3.1 单因素试验设计 在单因素试验设计中，在初始培养基（碳源：蔗糖30 g/L；氮源：水解酪蛋白3 g/L；培养温度 25 ℃）的基础上分别对碳源种类和浓度、氮源浓度和培养温度进行优化。试验依次进行，后续试验均应用前面试验得出的最优结果。
碳源：使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉作为单独碳源，维持起始浓度均为30 g/L，考察不同来源碳源对发酵后细胞干质量及总异黄酮合成量的影响。在此基础上采用蔗糖为基础碳源，测试10、20、30、40、50、60 g/L起始条件下对发酵后干细胞总质量与总异黄酮合成量的影响。
氮源：调节MS培养基中的水解酪蛋白浓度分别为0.5、1、2、3、4、5 g/L，经过12 d封瓶批次发酵后测量总细胞干质量以及总异黄酮的合成量。
培养温度：分别采用10、15、20、25、30、35 ℃条件培养鸡血藤悬浮细胞，考察最终发酵细胞总干质量及总异黄酮的合成量变化。
1.3.2 Box-Behnken中心组合试验设计 在单因素试验的基础上，对蔗糖、水解酪蛋白、培养温度进行Box-Behnken中心组合试验设计。
1.4 细胞生长和异黄酮含量测定
发酵12 d后，收集鸡血藤细胞培养物，60 ℃下干燥至恒质量，细胞生物量为1 L培养基收获的细胞干质量（g/L）。将细胞充分研磨后于95%乙醇冷浸24 h，超声波处理 30 min，过滤。提取3次，合并滤液，40 ℃下减压浓缩，100 mL乙酸乙酯 ∶水（体积比5 ∶1）混合溶液萃取3次。而细胞过滤发酵液经低温冷冻浓缩后直接通过乙酸乙酯萃取抽提。
合并乙酸乙酯抽提液，于40 ℃下减压蒸馏。甲醇溶解定容至5 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后HPLC定量分析。色谱条件：Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱：Purospher Star C18柱（4.6 mm i.d.×250 mm，5 μm），流动相为甲醇 ∶水 ∶乙酸（体积比10 ∶10 ∶1）溶液，柱温25 ℃，进样体积20 μL，流速1.0 mL/min，检测波长260 nm。以外标法计算异黄酮含量，单体标准品分别是大豆黄酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂异黄酮（购自Sigma公司，纯度为98%）。总异黄酮含量为细胞内及发酵液上清中异黄酮含量之和，以1 L培养液内4种异黄酮的总量表示（mg/L）。
1.5 统计分析
试验数据用x±s表示（n=3）。使用SPSS 19.0进行单因素方差分析和多重比较分析（LSD），使用Design Expert 8.0.6 进行Box-Behnken中心组合试验设计和数据回归分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
培养基成分和培养温度对鸡血藤悬浮细胞产异黄酮的影响见图1。碳源和氮源是培养基的主要成分，也是产物产量最重要的限制因子[9]。在4种碳源（浓度均为30 g/L）中，蔗糖最有利于鸡血藤悬浮细胞培养，细胞干质量和总异黄酮含量均显著高于其他碳源（P<0.05），优选蔗糖作为碳源（图1-A）。在蔗糖浓度的单因素试验中，随着蔗糖浓度的增加，鸡血藤悬浮细胞细胞干质量和总异黄酮含量也随之增加，在蔗糖浓度40 g/L时达到最高值，分别为（10.97±0.75） g/L和 （495±0.42） mg/L，继续增加蔗糖浓度细胞干质量和总异黄酮含量不再增加（图1-B）。因此，选择40 g/L 蔗糖作为鸡血藤悬浮细胞培养的碳源。
在氮源的单因素试验中，也发现与蔗糖浓度类似的趋势。水解酪蛋白（氮源）的浓度为4 g/L时，鸡血藤悬浮细胞干质量和总异黄酮含量均达到最大，分别为（9.75±0.68） g/L和 5.05±0.45 mg/L，因此选择4 g/L水解酪蛋白作为鸡血藤悬浮细胞培养的氮源（图1-C）。
此外，在植物细胞的培养中，培养温度是重要的条件限定因子[10]。随着培养温度的升高，鸡血藤悬浮细胞干质量和总异黄酮含量增加（图1-D）。当温度为20 ℃时细胞干质量最高（11.95±0.78） g/L，温度为25 ℃时总异黄酮含量最高 （5.05±0.45） mg/L，而温度继续上升总异黄酮含量大幅下降。综合考虑细胞干质量与总异黄酮含量，选择培养温度为25 ℃以获得最大的异黄酮产量。
2.2 Box-Behnken中心组合试验
根据单因素试验结果，以总异黄酮含量（Y）为量化指标，选取蔗糖（A）、水解酪蛋白（B）、培养温度（C）进行Box-Behnken 中心组合试验设计，每个因素的低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码，中心组合因素水平见表1。Box-Behnken 中心组合设计方案和试验结果见表2。
对响应值进行多元二次回归拟合分析，得到以下回归预测模型：总异黄酮含量Y=5.09+0.08A+0.11B-0.19C+0.12AB+0.30AC+0.29BC-0.25A2-1.21B2+0.032C2。对回归模型拟合度及其显著性进行检测，结果见表3。其中回归方程P<0.001，达到极显著水平。模型的确定系数为 0.970 3，经调整后为0.936 8，表明仅有7%的总异黄酮含量变异不能用该模型拟合，而拟合方程残差图基本为一条直线，说明此回归模型能极好地对试验结果进行拟合。
2.3 响应面图分析
响应面图分析可以直观地显示优化区域以及各因素对产量的影响[10]，根据回归方程得到的响应面图见图2。比较3个响应面图可知，培养基碳源和氮源交互效应对总异黄酮含量的影响较大，表现为交叉响应面图中曲面较陡峭；培养温度和碳源交互效应影响较小，表现为交叉响应面图中曲面较平滑；培养温度和碳源的交互效应居中。此结果与回归方程得
到的结果是一致的，3个因素的F值大小依次为水解酪蛋白（B）>培养温度（C）>蔗糖（A）。可见，培养基中最主要限制因子的是氮源（酪蛋白）的含量，而培养温度对鸡血藤细胞干质量和总异黄酮含量也有较大影响。
2.4 最佳工艺条件预测和试验验证
通过上述回归模型求偏导，得出培养基成分和培养温度的最佳工艺条件为蔗糖39.3 g/L，水解酪蛋白3.95 g/L，培养温度22.7 ℃。在此工艺条件下培养5批，鸡血藤悬浮细胞干质量和总异黄酮含量平均值分别为11.65 g/L和5.34 mg/L。总异黄酮含量与预测值5.41 mg/L相差比例仅为2.65%，说明该模型准确有效，能反映试验实际情况。
3 结论与讨论
分别通过单因素试验和Box-Behnken中心组合试验来优化鸡血藤悬浮细胞产异黄酮的培养基组成和培养条件。单因素试验结果指出碳源优选为蔗糖，培养基配方为蔗糖 40 g/L，水解酪蛋白4 g/L，培养温度25 ℃。进一步进行 Box-Behnken 中心组合试验，结果指出最佳工艺条件为蔗糖 39.3 g/L，水解酪蛋白3.95 g/L，培养温度22.7 ℃。验证试验中，此优选工艺下鸡血藤悬浮细胞干质量和总异黄酮含量平均值分别为11.65 g/L和5.34 mg/L。总异黄酮含量与预测值5.41 mg/L相差比例仅为2.65%，说明该模型准确有效，能反映实际试验情况。响应面法优化后，鸡血藤悬浮细胞产异黄酮比初始培养条件提高了12.31%。响应面法优化大幅度提高了鸡血藤悬浮细胞产异黄酮含量，为鸡血藤异黄酮的深入开发提供了技术基础。
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