打开文本图片集
摘要：以鸭梨为试材，利用透射电镜显微技术和组织化学技术对梨果实石细胞分化及次生壁形成过程进行研究。结果表明，石细胞分化始于开花第7天，原生质体收缩于细胞一侧，随后胞内出现颗粒状凝聚物，次生壁逐渐增厚，之后胞质继续收缩消失，早期形成的石细胞多以群体形式同时出现。石细胞次生壁形成是逐步进行的，即先形成纤维素或半纤维素网架结构，再进行木质化填充。透射电镜下石细胞分化过程中依次呈现出细胞核染色质凝聚、细胞核变形、核膜界限不清晰的现象；胞内出现同心层次的自噬泡，形成大量囊泡；细胞核消失，内质网断裂并大量增生，质膜向内突起形成泡状结构；次生壁增厚，胞内细胞器仅有线粒体和内质网，最终细胞质收缩消失。
关键词：鸭梨；石细胞；分化；程序性死亡
中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）19-5021-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.031
Abstract： Taking Yali pear as test material， the microstructure， ultrastructure and lignin deposition process of stone cells in Yali fruitlets during the early differentiating period were examined by using light microscopy and transmission electron microscopy（TEM）. The results showed that all stone cell clusters in Yali pear fruitlets started to differentiate almost simultaneously on the 7th day after full bloom. Entocyte in some parenchyma cells was clustered together and aggregated at one side， which was the start of stone cell differentiation. Then， these parenchyma cells showed small and scattered granular cytoplasm. With the thickening of the secondary wall in these cells， the stone cell formed. It was also revealed that most of former stone cells differentiated at the same time. Ultrastructure was examined by using transmission electron microscopy and the results showed that the initial nucleus was regular roundness，the first sign of this degeneration was the condensation of the cytoplasm，then chromatin condensed， karyotheca degeneration，and nucleus deformity finally disappear in the cell. Autophagic vacuole was observed in the cytoplasm， then more and more vesica appeared，and endoplasmic reticulum proliferation and dilation，followed by blebbing of the plasma membrane. With the thickening of secondary wall，cellular organelles including mitochondria and endoplasmic reticulum still well preserved，and at last the cytoplasm shrunk and disappeared.
Key words： Yali pear； stone cell； differentiation； programmed cell death
梨果酸甜适口、多具芳香，深受人们喜爱。中国和日本等国家是世界上最主要的东方梨生产国，东方梨具有肉质多汁、风味香甜等优点，但因其果实中石细胞含量高而影响了梨果的鲜食品质和加工品质。石细胞一般是由薄壁细胞经过次生壁强烈增厚并高度木质化而来，梨果实石细胞在分类上属于短石细胞[1]，在果肉中呈团状出现。不同品种梨的石细胞形态、数量及分布状态存在很大差异，是鉴别梨果肉品质的重要依据[2-4]，石细胞团的大小、密度和分布是梨果实中较稳定的性状之一[4]，现已成为梨主要原产、生产国和有关国际组织为规范梨种质资源鉴定而确立的评价指标之一[5]。国内外学者对于石细胞的发育开展了大量的研究，多集中于石细胞整体发育、结构成分以及石细胞与果实品质之间的关系[4，6-8]。对于石细胞分化过程研究尚少，石细胞是如何从薄壁细胞转变为次生壁增厚的细胞，其机理尚不清楚。石细胞是一种厚壁类细胞，目前已经对与之类似的导管[9]、筛管[10]、纤维[11]等开展了大量研究，它们的形成均为细胞程序性死亡过程（PCD），而对于薄壁细胞向石细胞演化过程鲜见报道。本研究探讨了鸭梨石细胞的分化过程及机制，旨在为生产中采用合理的栽培措施，以减少梨石细胞的形成，从而改善梨果实品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及取样
试验地为河北农业大学标本园，位于河北省保定市郊区，为冲积平原潮土，黏壤，肥力中等，树龄12年生，生长结果正常，花期平均温度16.2 ℃，相对湿度30%～50%。供试材料为盛果期鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）。4月初蕾期选择生长势一致的鸭梨树10棵，于花蕾大气球期在树冠的中层南部选择花蕾发育期基本一致的短果枝挂牌，每花序只留第1、2朵边花。开花当日采用雪花梨花粉授粉，采集开花0～20、30、40 d及成熟期的果实。
1.2 试验方法
1.2.1 石细胞分化过程显微结构观察 在幼果赤道线附近横切，用锋利的刀片快速地切取组织，切成3 mm3的小块，迅速投入含有4.0%多聚甲醛和2.5%戊二醛（用0.1 mmol/L pH 7.6的磷酸缓冲液配制）固定液中，乙醇脱水，二甲苯过渡，石蜡包埋，6 μm切片，番红固绿对染，Olympus显微镜镜检，显微成像系统（DN-2）采集图像。
1.2.2 木质素定位 参照Rahman等[12]的方法，利用Wiesner法检测石细胞次生壁的木质化进程，样品经固定、脱水、包埋及切片同“1.2.1”，经复水和清洗，在制片上加适量1%间苯三酚及6 mol/L HCl，镜检，DN-2系统采集图像。
1.2.3 超微结构观察 用锋利的刀片快速地切取果实组织，切成1.0 mm×0.5 mm×0.5 mm小块，转入含有0.1 mol/L二甲砷酸钠的2.5%（V/V）戊二醛固定液（pH 7.2）中，4 ℃下初固定3 h，冲洗后转至1% OsO4（0.1 mol/L二甲砷酸钠配制）中，4 ℃固定。梯度乙醇脱水，丙酮过渡，Spon812包埋，超薄切片机（LKB-5，Sweden）切片。铀染和铅染后，在透射电镜（JEM-1400型，Japan）下观察和采集图像。
2 结果与分析
2.1 石细胞分化期的显微结构变化
开花当日（图1-a），花托内为大量薄壁细胞，其相对较小，排列紧密，略呈多边形，细胞质浓。开花后第7天，薄壁细胞增大，靠近果心部位聚集出现胞质凝聚细胞，其中央大液泡完全形成（图1-b）。从开花后第9～11天，在靠近果心部分和果肉中部先后出现胞质呈颗粒状凝集状细胞（图1-c和图1-d），最初颗粒较小，后聚集逐渐变大，这些均为石细胞前体细胞，其多以群体形式出现，偶见有单个出现。开花后第12天，次生壁增厚石细胞出现（图1-e），其位置并不一定位于石细胞前体群中央，次生壁已增厚但对番红着色能力差，说明木质化程度较低。开花后第13天，石细胞的次生壁显著增厚，其原生质体凝聚于细胞中央（图1-f），周围有许多正在分化的石细胞前体薄壁细胞。开花后第15～18天，石细胞团呈现（图1-g），石细胞次生壁继续增厚，细胞质收缩更加明显。开花后第20天，石细胞团中大部分细胞次生壁增厚明显，先期形成的石细胞中个别细胞的细胞质已趋于殆尽（图1-h）。开花后第40天，早期形成的石细胞团中大部分细胞次生壁完全加厚，细胞质已完全转移，其周围仍有石细胞处于分化后期（图1-i）。此外还发现组织中有许多胞质凝聚的细胞出现（未列出图片），说明石细胞在大量形成。至果实成熟期，石细胞形态与开花后第40天一致，周围薄壁细胞较开花后第40天明显增大（图1-j）。
2.2 石细胞分化期次生壁的木质化进程
经Wiesner反应，开花当日薄壁细胞未着色，细胞壁木质素含量较少或无（图2-a）。开花后第9天，胞质凝聚期细胞中颗粒物也未着色（图2-b），说明石细胞分化前期并未大量存在木质素。首个石细胞出现（开花后第12天）时其胞壁增厚（图2-c），次生壁未大量沉积木质素，与周围薄壁细胞一致。待石细胞团初步形成时（开花后第15天），部分胞壁呈浅桃红色，说明存在木质素单元，但含量较低（图2-d）。开花后第16天，石细胞团分布于果肉不同部位（图2-e），次生壁迅速加厚，其靠近初生壁部分着色较深，向内递减，说明木质素分布由外向内逐渐降低（图2-f）。开花后第18～20天，石细胞次生壁显著增厚呈桃红色，呈向心式变浅（图2-g和图2-h），其细胞质也被染成棕褐色。
2.3 石细胞分化期的超微结构变化
开花当日薄壁细胞胞质浓厚，细胞器丰富，原液泡聚集，初生壁薄而平整，胞壁零星分布初生纹孔场，细胞核呈球形，边缘整齐，核质浓厚，内质网整齐（图3-a）。开花后第5天，液泡聚集形成中央大液泡（图3-b），部分薄壁细胞细胞核染色质开始凝聚，向核膜边缘靠近，核形状趋于不规则，略呈瓣裂状（图3-b-1），初生壁增厚，其附近细胞质中可见高尔基体、线粒体等细胞器，细胞出现具双层膜结构的运输小泡（图3-b），同时一些细胞中见到同心圆潴泡结构（图3-c）。开花后第7天，细胞器凝聚于一侧（图3-d），胞壁上具发达的胞质通道与相邻的细胞相连，液泡膜开始出现破裂（图3-d-2）。开花后第8天，胞质浓度增加，内质网断裂成几部分（图3-e-3），粗糙内质网大量增生，或向内包吞细胞质组成泡状结构（图3-e-4）。部分细胞内出现大量单层膜泡状结构（图3-f），有的形成包围多个细胞器的自噬泡（图3-f-5）。开花后第9天，胞质先凝聚为小颗粒状，后聚集成较大颗粒，并向细胞膜边缘聚集，质膜内陷形成许多小泡（图3-g）。开花后第10～11天，细胞质聚集于质膜附近，细胞核降解，细胞壁内侧趋于不平整（图3-h），质膜与细胞壁之间囊泡体（图3-i-6）、质膜向内形成了大量的运输小泡（图3-i）。开花后第12天，石细胞显现，质壁分离，未见细胞核，胞质内残存细胞器，次生壁增厚但整体较薄，其与初生壁电子密度相近，说明二者成分相近（图3-j）。开花后第14天，在初生纹孔场位置次生壁并未增厚，形成纹孔道，在次生壁内侧有可见厚度的一层结构（图3-k），这层结构与初生壁相近，细胞质内形成大量囊泡（图3-k-7），次生壁增厚，纹孔道形成。开花后第18天，胞质内形成大量粗糙内质网（图3-l）以及内质网包围细胞质形成泡状结构，部分内质网末端与线粒体相连（图3-l-8）。开花后第20天，细胞次生壁继续增厚，胞质向中心凝聚，仅剩大量线粒体、粗糙内质网和许多囊泡状结构（图3-m）。开花后第40天，最早完成分化石细胞，次生壁完全形成，胞内无细胞质，胞间层和初生壁电子密度明显大于次生壁（图3-n）。普通薄壁细胞在发育过程中，保持完整的细胞核，其核膜核仁清晰可见，仅形成均匀厚度的初生壁（图3-o）。
3 讨论
3.1 石细胞的分化时间及形式
刘庆华等[13]、阿拉木萨等[4]认为石细胞团在形成过程中，首先薄壁细胞中有个别细胞壁变厚称之为原基细胞，后来以原基细胞为中心，周围的薄壁细胞继续增厚，形成新的石细胞，围绕原基石细胞逐渐积累形成石细胞团。砀山酥梨[7]石细胞出现于果实发育中期（花后第15～23天），部分细胞壁不均匀加厚形成石细胞，最后石细胞聚簇形成石细胞团。从分化时间而言，前人研究认为石细胞分化始于花后两周，由单个石细胞出现为开始，称该细胞为石细胞原基，这与本研究中石细胞出现的时间相近。然而，石细胞次生壁的出现说明细胞壁已经发生了特化[14]，本研究采用的固定剂有效地区分了分化前期的石细胞（即次生壁未增厚的细胞）和普通薄壁细胞。故认为石细胞的分化应以薄壁细胞的胞质聚集于胞内一侧为起点，始于花后1周。从分化形式上而言，在分化初期石细胞团多以群体形式同时分化，少数以单个形式出现。前体期石细胞密集出现，其中某个细胞分化速度较快，先出现次生壁增厚，该细胞可能位于群体中间，亦或位于一侧，紧随其后出现的石细胞也并不一定是与之相邻细胞，而是周围多个细胞近乎同时形成次生壁。石细胞团分化类似于原生木质部和后生木质部分化形式，因此称石细胞原基为“始石细胞”或“原生石细胞”更为恰当。
3.2 石细胞次生壁的分化与木质素沉积
吕芮宏等[15]指出石细胞含量与木质素呈显著正相关，果实发育期木质素含量也与石细胞的含量变化存在相关性[8]。于娟娟等[16]认为木质素沉积在石细胞的细胞壁上，从而使次生壁加厚，也有研究认为石细胞的木质素积累是由最外侧开始，然后透过细胞膜向细胞质发展而最终形成石细胞[17]。与石细胞同为厚壁类细胞的导管，次生壁木质素总量由外向内先持续减少至最小值，到内侧壁略有增大[18]。次生木质部导管和管胞形成次生壁时，先由纤维素微纤丝定向排列，其间有一些半纤维素成分连接，具孔隙结构，此后随着木质化的进行，这些孔隙被球形小体填充，最后才形成具有十分致密结构的次生壁[19]。鸭梨石细胞次生壁初现时，易被固绿着色，说明其含有较多的纤维素和半纤维素，Wiesner反应弱证明木质素含量很少。随着次生壁的逐渐增厚，靠近外侧的次生壁易于番红着色， Wiesner反应结果也证明外侧细胞壁木质素高于内侧。由此判断石细胞分化与导管分化相近，初期并未沉积较多的木质素，而是形成了纤维素和半纤维素的网架结构，此后才逐步在网架内部进行填充。石细胞刚出现时，电镜下其新形成的次生壁与初生壁电子密度相近，当次生壁增厚到一定程度时，仍然可见在次生壁的内侧有一电子密度较大的层次，而随着次生壁的增厚该层逐渐不明显，说明石细胞次生壁形成是逐步进行的，即先形成纤维素或半纤维素网架结构，再进行木质化填充。
3.3 梨果实石细胞PCD的初步证据
Kerr等[20]将细胞死亡分为两类，即程序性死亡和坏死，程序性死亡过程不同于坏死在于其有明显的时序性，其中细胞核是否发生特异性变化是衡量PCD发生的重要形态特征之一[21]。导管分子分化过程中细胞核由最初的纺锤状变为形状不规则，后出现缢缩或出芽，染色质凝聚，分化后期核膜较完整，最终才出现核膜消失及核崩解[22]，该现象也存在于美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）小孢子发育[23]、水烛香蒲（Typha angustifolia）的通气组织形成[24]、柑橘（Citrus）气孔器保卫细胞[25]程序性死亡过程。梨果实石细胞分化早期（薄壁细胞期）即出现了细胞核的染色质凝聚以及细胞核的瓣裂状，后呈空泡状并逐渐解体，次生壁出现之后细胞核已无踪迹，说明石细胞分化具有PCD特征。此外，其细胞器和质膜变化同样具有时序性，分化前薄壁细胞内质网整齐，随后发生断裂并持续增生，形成泡状或线状结构或部分与线粒体相连，这种现象也存在于导管形成过程中[22]。石细胞分化早期质膜保持完整，后质膜逐渐内陷形成许多泡状结构，线粒体始终保持完整的结构，直至最后原生质体高度收缩后依然可见线粒体，与猕猴桃[23]小孢子PCD过程一致，这些特征均说明石细胞分化具有PCD特征。
4 结论
石细胞分化以薄壁细胞细胞质聚集为起点，薄壁细胞中央大液泡将胞质挤于一侧，细胞核染色质出现凝聚、细胞核变形、核膜界限不清晰，此后胞内出现同心层次的自噬泡，胞质凝聚成颗粒状，胞内形成大量囊泡，后细胞核消失，内质网断裂并大量增生，质膜向内突起形成泡状结构，随后次生壁增厚，胞内细胞器仅有线粒体和内质网，最终细胞质收缩消失，整个过程具有细胞程序性死亡的特征。
参考文献：
[1] 金银根.植物学[M].第二版.北京：科学出版社，2010.70.
[2] 1388-2007 NT，梨果肉中石细胞含量的测定 重量法[S].
[3] 牟其芸，李文香，张华云，等.梨果实中石细胞含量测定及与果实品质相关性的研究[J].落叶果树，1996，28（1）：7-9.
[4] 阿拉木萨，李宝江.梨果实石细胞团的发育、分布及其对果实品质的影响[J].北方果树，1999（4）：4-6.
[5] 曹玉芬，刘凤之，王 昆，等.梨种质资源主要描述标准比较分析[J].植物遗传资源学报，2005，6（4）：460-463.
[6] 田路明，曹玉芬，高 源，等.梨品种果肉石细胞团大小对果肉质地的影响[J].园艺学报，2011，38（7）：1225-1234.
[7] 聂敬全，蔡永萍，张士鸿，等.砀山酥梨果实石细胞与薄壁细胞发育关系的解剖学研究[J].园艺学报，2009，36（8）：1209-1214.
[8] CAI Y，LI G，NIE J，et al.Study of the structure and biosynthetic pathway of lignin in stone cells of pear[J].Scientia Horticulturae，2010，125（3）：374-379.
[9] 张宗申，利容千，王建波.导管分子程序化死亡过程中Ca2+的时空变化[J].科学通报，2001，46（13）：1098-1100.
[10] 李继伟，邓祥宜，周竹青，等. Ca2+和Ca2+-ATPase在小麦颖果筛分子分化中的动态变化[J].中国农业科学，2009，42（12）：4209-4217.
[11] 甘小洪，丁雨龙.毛竹茎秆纤维发育过程的超微结构观察[J].植物学通报，2004，21（2）：180-188.
[12] RAHMAN M M，ISHIGURI F，TAKASHIMA Y，et al. Anatomical and histochemical characteristics of Japanese birch（Tohoku） plantlets infected with the Inonotus obliquus IO-U1 strain[J].Plant biotechnology，2008，25（2）：183-189.
[13] 刘庆华，王奎玲，周启河，等.梨果肉石细胞的形态结构与果实品质的关系[J].莱阳农学院学报，1992，9（4）：252-255.
[14] ZHONG R，YE Z H. Secondary Cell Walls，Encyclopedia of Life Sciences（ELS）[M].Chichester：John Wiley & Sons，Ltd.， 2009.1-9.
[15] 吕芮宏，张士鸿，聂敬全，等.不同基因型梨木质素代谢对石细胞含量和果实口感的影响[J].激光生物学报，2011，20（6）：765-771.
[16] 于娟娟，李 玲，金 青，等.砀山酥梨石细胞发育过程中木质素代谢关键酶POD类型的分析[J].园艺学报，2011，38（6）：1037-1044.
[17] TAO S，KHANIZADEH S，ZHANG H，et al. Anatomy，ultrastructure and lignin distribution of stone cells in two Pyrus species[J].Plant Science，2009，176（3）：413-419.
[18] 王 瑞，汪佑宏，刘杏娥，等.黄藤材导管壁木质素分布可见光谱分析[J].东北林业大学学报，2011，39（8）：50-51.
[19] 贺新强，崔克明.植物细胞次生壁形成的研究进展[J].植物学通报，2002，19（5）：513-522.
[20] KERR J F，WYLLIE A H，CURRIE A R.Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J]. British journal of cancer，1972，26（4）：239-257.
[21] DANON A，DELORME V，MAILHAC N，et al. Plant programmed cell death：a common way to die[J].Plant Physiology and Biochemistry，2000，38（9）：647-655.
[22] 王雅清，崔克明.杜仲次生木质部导管分子分化中的程序性死亡[J].植物学报，1998，40（12）：1102-1107.
[23] COIMBRA S，TORRAO L，ABREU I. Programmed cell death induces male sterility in Actinidia deliciosa female flowers[J]. Plant Physiol Biochem，2004，42（6）：537-541.
[24] NI X L，MENG Y，ZHENG S S，et al. Programmed cell death during aerenchyma formation in Typha angustifolia leaves[J]. Aquatic Botany，2014，113：8-18.
[25] 黄镜浩，温寿星，张艳芳，等.柑橘春梢叶片Ⅰ型气孔保卫细胞程序性死亡的研究[J].园艺学报，2013，40（11）：2153-2160.