禽流感（avian influenza，AI）是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类从呼吸系统到全身性的感染和/或疾病综合症，根据疫情发生的严重程度，可分为高致病性禽流感（HPAI）、低致病性禽流感（LPAI）和非致病性禽流感（NPAI）。病禽出现从无症状到厌食、精神萎顿、减蛋等临床症状，以至突然暴发、高度死亡。其中，HPAI因其造成极其严重的疫情和损失，被国际兽疫局（OIE）列为A类传染病，我国把它定为一类传染病。
对禽流感及时而正确的诊断十分重要，以能采取果断的控制措施。本病必须进行综合分析，尤以实验室诊断最为重要。
一、现场诊断
根据流行病学，临诊症状及剖检变化只能作出可疑诊断。由于禽流感的现场表现（发病特点、症状及剖检变化）差异较大且无典型性，所以要确诊必须依靠病原分离鉴定及血清学试验。
二、病原分离、鉴定
A型流感病毒常在呼吸道或/和消化道中复制增殖，所以，活禽采集病料多从喉头、气管或泄殖腔中采集。死禽采集气管、肝、肺、脾、肾等组织样品。
以棉花或其他材料制成的拭子、器具采集病料样品，放入加抗生素的无菌肉汤或20%～50%甘油生理盐水中。最好低温4℃或-70℃下保存，以液态氮或干冰较好。病料样品在保存或运送前可先行处理，制成10%的悬液，并进行低速离心澄清。
经离心的病料上清液接种SPF鸡胚，取0.1ml，经尿囊腔途径接种（或同时羊膜腔接种）9～11日龄的鸡胚，置37℃孵育3～7，天弃取24h内死去的胚，收集48h至96h的胚液和绒毛尿囊膜作无菌检查，检查鸡胚尿囊液对红细胞的凝集活性。血凝阴性者，用尿囊液盲传2～5代，如仍未出现血凝时，判为阴性，弃去。如出现血凝活性则进一步检查。
一般来说，如样品中有病毒存在，初次传代后就足以产生红细胞凝集作用。出现血凝活性的病毒一般为10-5-10-6 EID 50/ml。
用于病毒鉴定的标准方法是以鸡红细胞来检测胚液的血凝活性，常量法和微量法都可使用。
确定尿囊液或其他胚液的血凝活性后，还要鉴别是否由副粘病毒鸡新城疫病毒（NDV）所致。因此，首先要用ND抗血清作HI试验，以排除NDV的可能性。如果NDV HI阴性，才可以进行下一步工作，即确定A型流感病毒NP抗原的存在。可用血清学方法，如双向双扩散、免疫电泳或单辐射溶血试验等方法来检测型特异性的核心抗原NP或MP。A型流感病毒都具有相同的型特异性抗原。
鉴定程序下一步工作是确定血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）这两种表面抗原的亚型。用一系列制备好的抗不同血凝素的抗血清以HI试验来测定其HA的型别。
NA亚型通常用制备的抗9种或10种已知神经氨酸酶的抗血清鉴定。微量神经氨酸酶抑制试验（NI）操作更简便。已知目前的HA亚型达16种。NA也达到了10种亚型。
目前国内只有极少数实验室具备鉴定的条件，可将待检材料送往有条件的专业实验室去进行病毒分型鉴定。
三、血清学试验
1.血凝试验与血凝抑制试验
用血凝试验与血凝抑制试验（HI）可证实流感病毒的血凝活性及排除NDV。简单的方法是：取1滴1：10稀释的正常鸡血清（最好是SPF鸡）和一滴ND抗血清，分别滴于瓷板上，再各加1滴有血凝活性的鸡胚尿囊液，混合均匀后各加1滴5%的鸡红细胞悬液，若两份血清均出现血凝现象，则表明尿囊液中不含有新城疫病毒（NDV）；如果ND抗血清出现HI现象，表明尿囊液中含有NDV。
一般情况下，新分离毒株要鉴定出型特异性NP或MP抗原型（有琼脂扩散法），确定为流感病毒时，再做HA亚型的鉴定。
新分离的AIV毒株可用HI试验与以前分离的毒株或标准株进行比较。多用4个血凝单位的病毒与以前的阳性血清和0.5%鸡红细胞进行HI试验，或与新近发生的AIV的血清进行HI试验，可鉴定新分离毒株与已知株是否具有相同的HA亚型。准确的鉴定还是要用特异性的H1-H16亚型的抗血清进行交叉HI试验。
血凝试验和血凝抑制试验除常量法和微量法外，还有加敏法。即抗原与抗体4℃或室温下结合1～2h后，再加入1%鸡红细胞，该法则抗体的效价比常规法高2～4倍。如果抗原用乙醚裂解，敏感性比常规法高4～16倍。但观察时间不宜太久，以30min内为好，否则易出现假阳性。
许多禽类血清（包括其他多种动物血清）都含有非特异性的血凝抑制因子（抑制素）。这是一种与红细胞表面受体相似的粘蛋白物质，能与红细胞表面受体竞争性地与病毒表面的血凝素所吸附。禽类血清中的抑制素属α型（已知有α、β、γ三种）。
因此，血凝抑制试验时，首先要除去这些非特异性的血凝抑制因子。常用的处理方法有受体破坏酶（RDE）法（即霍乱滤液）和高碘酸钠法。
血凝和血凝抑制试验操作相对繁杂些，加上需制备抗血清，所以也较费时间。但特异性较好，是亚型鉴定中必须进行的项目。用于型的鉴定就不如琼脂扩散试验那样简便快捷。
2.琼脂凝胶扩散试验
在琼脂凝胶中进行的抗原抗体反应比较简便、快捷，即可以定性（如免疫双扩散及免疫电泳中以沉淀线判定），又可以定量（如单辐射扩散）。
由于所有的AIV亚型都具有特异性RNP共同抗原（即AIV的“核心抗原”—NP或MP其保守性很强，基本上不发生变异），所以，可用一种AIV的抗原或抗血清对所有A型禽流感病毒的抗体或抗原进行鉴定。
抗原可用标准株或已知毒株自行制备。一般都采集有血凝活性的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM），用PH7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗CAM后，吸干，磨碎，反复冻融3次或超声波处理，再3000rpm离心30min，去上清夜加入甲醛（至终浓度为0.1%），37℃灭活36h，即可应用。国内也有报道用0.2%甲醛38.5℃灭活48h，据说这种方法制备的抗原效果最好。
琼脂扩散（AGP）试验最常用的是双向双扩散（或称免疫双扩散）。即用已知的阳性和阴性血清与待检抗原及已知抗原，在琼脂凝胶中进行免疫双扩散。室温下作用24h，已知抗原和阳性血清之间应出现明显的沉淀线，48h内部应很清晰。当待检抗原与阳性血清间出现沉淀线，并且沉淀线与邻近的阳性抗原和抗血清的沉淀线相连，即可判定为阳性反应，待检抗原即为A型禽流感病毒。这是国内目前普遍采用的方法。毕英佐1994年报道，对广东10个养鸡场29群324只鸡检查，11个阳性群，鸡只阳性最低10%，最高80%。张泽纪等1994年报道，1992～1994年血检1个肉鸡场阳性率20%，2个种鸡场阳性率61%。
除了双向扩散试验（IDD）外，在凝胶中进行的免疫沉淀试验还有：免疫单辐射扩散试验（SRD），即制胶时先加入抗原或抗体的一种，而让另一种在凝胶中进行扩散。这种方法还可以定量测定抗原或抗体的量。这种方法还可以称作被动溶血试验，即单辐射溶血试验（SRH），此时凝胶重要加入红细胞，在补体存在下抗原抗体复合物使沉淀环出现溶血现象，也可以对抗原或抗体进行定量。
免疫电泳试验也可以用于AIV及其抗体的检测，使用较多的是对流免疫电泳（CIE）。几种方法相比较，免疫双扩散（IDD）要比SRD更简便一些，但其敏感性不如SRD好。但SRD需对抗原进行裂解处理，操作较为复杂。SRH的敏感性类似SRD，比IDD要高，但操作更为复杂，其优点在于可定量分析。
对流免疫电泳（CIE）是这几种方法中最为敏感的一种，而且操作简单时间最快，1h即可出结果。
但是，作为免疫沉淀试验，不管是IDD、SRD，还是CIE，都需在凝胶中进行，其检出的敏感性毕竟是有限度，对低滴度的样品（无论是抗原或是抗体）都会受到沉淀试验本身敏感性的局限。所以，用更敏感的试验方法进行检验和诊断是必要的。而且沉淀试验所需的试剂及抗原或抗体的量都较大。
另外，由于禽种类的差异，其免疫反应是不一致的，血清学检验时要注意这一点。例如火鸡和雉的NP抗体很容易检出，但在已知的感染鸭中很难检出。同时，用完整的病毒进行常规HI试验，检测不出感染鸭产生的抗体免疫扩散试验不能分辨病毒的亚型。
3.中和试验
以中和试验（NT）来鉴定或滴定流感病毒时，常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒（如NDV）的中和试验相同。
中和试验作为经典的方法在病毒鉴定中是很重要的，很多新的检测方法都要以之为标准来进行比较。但其操作相当烦琐，所费时间也长，试验材料耗费也多，故不常进行。
4.免疫荧光技术
免疫荧光技术即荧光抗体（Fluoresent Antibody）技术，可鉴定病毒感染细胞中特异性的抗原，主要是流感病毒的NP或MP抗原。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光。
禽流感病毒的诊断，常用于直接荧光抗体法，即在组织触印片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光。一种AIV的荧光抗体可以用来检测同亚型的其他病毒，荧光抗体的技术用于诊断，具有快速、简便、敏感等特点，而且费用较低。需要注意的是如何避免或降低标本中出现的假阳性问题（非特异性荧光）。
荧光抗体（FA）的敏感度同病毒分离相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。
对一株杂交瘤细胞分泌的流感病毒的单克隆抗体进行检测时，发现间接免疫荧光技术的敏感性比血凝抑制试验高40～150倍。间接免疫荧光技术也可以用来检测核蛋白（NP）及基质蛋白（MP）抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解。
5.酶免测定技术
酶免测定技术（Enzyme Immuno Assays），也称酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），是用酶来标记抗原或抗体，通过显色反应来检测相应抗体活抗原的一种方法。
ELISA有较高的敏感性，即可以检测抗体，又可以检测抗原。尤其适合于大批样品的血清学调查，可以标准化而且结果易于分析。在流感的控制、扑灭、检疫中很有用途。
试验表明，直接ELISA可于感染后6d检出AIV的抗体，敏感性也高于AGP及HI试验。简单程序（直接ELISA）为：从感染尿囊液中超速离心制备抗原，以抗原包被酶标反应板，加入待检血清后，再加入抗体（酶标），最后以酶标仪检测结果。
四、聚合酶链反应（PCR）
农业部动物检疫所吴时友等建立了从病科中检测AIV的PCR方法。哈尔滨兽医研究所于康震等也建立了PCR和反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）诊断方法。PCR方法敏感性较高，为AIV从病料中快速检出提供方法。
五、鉴别诊断
由于禽流感感染引起的流行特点、症状及病理变化与某些禽病相似，必须作出区别诊断，如鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性鼻炎、支原体、衣原体病、产蛋下降综合症等，特别是某些疾病的混合感染或继发感染，使病情更为复杂，给诊断带来困难或容易发生误诊，因此，类症鉴别诊断十分重要。
首先是与新城疫的区别诊断，由于禽流感与鸡新城疫的症状、病变很相似。一般来说，禽流感的潜伏期和病程比国内目前发生的新城疫为短。新城疫的病鸡呼吸困难，嗉囊和口中的积液、呼吸困难时的咕咕叫声、典型神经症状等各种表现常规的典型病变都较禽流感明显和具有特征性，加之，现场新城疫的紧急免疫效果等，都与流感不同。但两病的准确区别诊断，只能依靠实验室的诊断，最简便、实用的方法是病毒分离和血凝抑制试验（HI），ND抗血清抑制不了AIV的血凝作用，反之亦然。
禽流感与其他几种疫病的鉴别，根据流行特点、症状、病例剖检和实验室检查（病原学、血清学）等综合分析，是可以区别开的。同样继发或并发细菌病时通过病原分离工作便可以确定。
总之，对禽流感的诊断，实验室病毒的分离、鉴定，以及致病性试验都耗时较长，花费也较高，只有极少数的实验室能进行此项检查，在收到检查样品后不能在较短时间（48h）内作出诊断，确诊滞后于现场采取措施的要求。禽流感这类病疫的确诊越快、越早，损失就越小。如果，分离物鉴定为高致病的禽流感强毒，则要求发病现场采取及时、果断的扑灭措施；如分离物鉴定为中等毒力或低致病的禽流感病毒，则要求发病现场采取可行的控制措施；如分离物鉴定为无毒力的禽流感病毒，则需观察其流行动态。A型禽流感病毒血清亚型的变异监测也是应该重视的内容。