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摘要：为建立一种快速、特异、鉴别诊断猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫株，参考GenBank上公布的猪伪狂犬病毒gE基因序列设计了1对引物，以猪伪狂犬病毒核酸作为模板，PCR方法将扩增得到的核酸序列克隆到PEGM-18T载体上，将克隆载体转化到DH5α感受态细胞中，测序鉴定阳性重组质粒作为标准品建立猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法。结果表明，本研究所建立的猪伪狂犬病毒荧光定量PCR方法检测灵敏度可达10拷贝，与蓝耳病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒不发生交叉反应，具有良好的特异性和可重复性。此外，对33份疑似猪伪狂犬病料也作了检测，结果表明，2份病料均为阳性。本研究建立的猪伪狂犬病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、不发生交叉反应等优点，可用于日常猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫株的鉴别诊断。
关键词：猪伪狂犬病毒;荧光定量PCR技术;灵敏度;标准曲线
中图分类号： S858.285.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）07-0050-04
猪伪狂犬病（PRV）是由称猪疱疹病毒感染引起的一种高度接触性、传染性疾病。猪是本病的传染源及自然宿主，本病的暴发常可引起妊娠母猪的流产率增高、仔猪的神经症状、公猪因睾丸炎丧失种用价值以及成年猪的呼吸系统疾病，每年给我国养猪业造成严重的经济损失[1-3]。任何年龄段的猪感染PRV后均能形成潜伏感染，感染PRV的猪终身带毒。在一定条件下PRV病毒可以被激活，引起隐性猪的复发性感染和散毒。因此，及时地诊断PRV是预防和控制该病的有效手段。在病原学诊断方法中，荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、快速高通量等优点，广泛应用于多种动物疫病的诊断[4]。本研究根据PRV病毒核酸设计了1对特异性引物，建立了一种快速鉴别诊断PRV病毒的荧光定量PCR方法，为河南省漯河市猪伪狂犬病的早期鉴别诊断和病毒分离提供了一种快速检测和定性的方法，为后续猪伪狂犬病的净化提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料采集 漯河市问十乡一散养户母猪存栏量24头，其中初产母猪8头，经产母猪16头。2016年11月15日夜里该养猪场1头经产母猪产仔15头，2 d晚上有4头仔猪表现体温升高、食欲不振、精神萎靡、站立不稳等症状，3 d早上有5头仔猪相继死亡，另有5头仔猪相继发病并出现相似的临床症状，1头仔猪表现为典型的猪伪狂犬病临床症状，犬卧姿势、原地转圈运动、叫声嘶哑，随后体温下降很快死亡。根据临床症状和剖检结果判定为疑似猪伪狂犬病，对发病和死亡的仔猪进行无菌采血，并采集心脏、肝脏、肾脏、脑、脾脏等组织进行充分研磨，用于PRV病毒的鉴定。
1.1.2 毒株、试剂及仪器设备 本研究所用猪伪狂犬病毒细胞培养物，由河南省疫控中心赠送;猪伪狂犬病毒gE、gB抗体检测试剂盒，购于美国IDEX公司;猪伪狂犬病毒gE基因实时荧光定量PCR检测试剂盒，购自上海之江生物科技股份有限公司;SYBR Green荧光染料、PMD-18T载体、DH5α，均购自TaKaRa;2×Taq Mix、质粒提取试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司，14 mL摇菌管，购自美国BD公司。
1.1.3 仪器设备 酶标仪购自美国宝特公司，超低温冰箱购自中科美菱，电热恒温水浴锅购自上海树立仪器仪表公司，PCR仪、电泳仪均购自美国伯乐，荧光定量PCR仪购自美国热电公司，凝胶成像分析系统购自美国Protein Simple公司，台式高速冷冻离心机购自德国艾本德股份公司（Eppendorf AG），掌上离心机购自美国赛洛捷克，生物安全柜购自上海力申。
1.1.4 引物设计及合成 从NCBI上下载7个猪伪狂犬病毒保守基因gE基因核酸序列，用DNAMAN软件将以上7种序列进行比对，寻找突变率较低的区域用Primer 3在线软件进行引物设计，用Oligo 6对设计的多对引物进行评价，最终选择1对最优的引物作为本次荧光定量PCR方法建立所用引物（表1）。
1.2 方法
1.2.1 PRV gE抗体检测结果的判定 将无菌采集的6份猪血清用PRV gE/gB抗体检测试剂盒进行检测，结果判定依据试剂盒说明书：S/N值≤0.5判为抗体阳性;0.5 1.2.2 PMD-gE质粒的构建 以PRV全毒为模板，采用“1.1.5”节的引物进行扩增，反应条件：95 ℃ 5 min预变性;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30个循环;最后72 ℃ 延伸 10 min。反应结束后将PCR产物进行电泳和切胶回收，将回收产物与PMD18-T载体连接2 h并全部转入DH5α细胞中，加入無氨苄抗性的LB液体培养基，180 r/min摇菌1 h，取100 μL涂布到含有氨苄抗性的LB固体培养基上，37 ℃温箱过夜，挑取阳性单克隆菌落用PCR方法鉴定，并将鉴定为阳性的质粒送测序。将测序正确的质粒作为荧光定量PCR的重组质粒标准品，用Nanodrop测定质粒浓度并计算拷贝数，拷贝数=质粒浓度×6.02×1023/（660×质粒总长度）。
1.2.3 荧光定量PCR方法的建立和条件的优化 荧光定量PCR反应体系的组成：2×Mix 12.5 μL，PRV上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，无菌蒸馏水6.5 μL，DNA 2.0 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min预变性;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30个循环;最后72 ℃ 总延伸10 min。根据以上反应条件，以PRV病毒株为模板，分别对引物浓度范围（2.5～15.0 μmol/L）和退火温度（52～60 ℃）进行优化。
1.2.4 标准曲线的建立 将构建的PRV阳性质粒用无菌蒸馏水先稀释至1×108，再10倍系列稀释7个梯度，并且以每个稀释度的稀释液为模板，进行荧光定量PCR反应，反应条件按照优化好的条件进行。
1.2.5 荧光定量PCR特异性检测 将笔者所在实验室购买的猪瘟、猪蓝耳、猪圆环、口蹄疫病毒核酸连同猪伪狂犬病毒核酸，采用本研究所建立的诊断方法一同检测，以验证该方法的特异性。
1.2.6 重复性试验 分别取1×106、1×104、1×102拷贝/μL 质粒进行3次批内和批间的重复试验，计算本方法的变异系数，判定本检测方法是否可重复。
1.2.7 临床样本的检测 采用本研究所建立的PRV荧光定量PCR方法对6份猪伪狂犬病疑似病例进行检测，所得结果与PRV检测试剂盒进行对比，判定该方法是否能够用于临床样本的检测。
2 结果与分析
2.1 PRV gE/gB抗体检测结果
本试验将采集的6份仔猪血清做猪伪狂犬病毒抗体水平检测，检测结果见表2。由表2可知，发病猪场仔猪猪伪狂犬病gB抗体阳性数为0，gE抗体阳性数为6个。
2.2 引物扩增结果
使用设计好的引物，以PRV全病毒进行扩增，获得约 200 bp 的核酸条带（图1），与预期结果相符合。
2.3 PMD18-T-gE阳性克隆的鉴定
用设计的引物对克隆的载体进行阳性鉴定，结果见图2。由图2可知，该引物成功克隆出约200 bp条带，与预期结果一致。将PCR鉴定阳性的样品进行测序，测序结果正确。
2.4 荧光定量PCR反应条件的确定
为选择最优的荧光定量PCR反应条件，本研究同时设立在不同引物浓度和退火温度的条件下进行扩增，结果见图3。由图3可知，当引物浓度为0.02 μmol/L、退火温度为58 ℃时，电泳核酸条带丰度最好，无非特异扩增。
2.5 荧光定量PCR标准曲线的建立
用含有目的片段质粒作为标准品，将标准品浓度为 109 拷贝/μL 的质粒进行10倍稀释8个梯度，每个稀释度的质粒作为模板进行荧光PCR扩增。由图4、图5可知，每个稀释度的扩增曲线之间的距离均匀，标准曲线相关系数为3.42，R2值为0.998，扩增效率为102.426，每个稀释度的3个重复之间的标准差为0.243，说明定量结果精密度高、重复性好，本研究所建立的标准曲线参数优越于标准的规定，可用于猪伪狂犬病的定量检测。
2.6 荧光定量PCR方法的特异性和准确性
本研究将猪瘟、猪蓝耳、猪圆环、口蹄疫和猪伪狂犬病毒核酸作为模板进行荧光PCR扩增，结果显示，除了猪伪狂犬病毒外，其余病毒的扩增曲线均为直线且在基线以下，猪伪狂犬病毒的扩增曲线为典型的S形（图6、图7）。说明本研究所建立的荧光PCR检测方法具有良好的特异性和准确性。
2.7 荧光PCR检测方法的重复性和稳定性
分别抽取1×106、1×104、1×102拷贝/μL质粒进行3次批内和批间的重复试验，由表3可知，每个梯度的最终实测值数量级不变，常数在0.99～1.01之间，对应的CTsd值和变异系数见表3，同一批次3个浓度梯度3次重复试验的CT值变异系数<5%，说明本研究所建立的荧光PCR检测方法重复性好、稳定性高。
2.8 荧光PCR检测方法的灵敏度
由图8可知，扩增曲线各个稀释度间距均匀，线性范围在100～109 拷贝/μL，所建立的标准曲线斜率为-3.243，标准曲线的R2为0.998，扩增效率为102.426，当标准品的稀释度达到1×101 拷贝/μL时认可以看到明显的扩增曲线，对应的CT为2.46个，当标准品的稀释度达到1×100 拷贝/μL 时，仍有扩增曲线，CT为35.43个，拷贝数为2.158拷贝，已超出可信范围，所以本研究所建立的荧光PCR检测方法最低检测范围为10拷贝/μL。
2.9 荧光PCR检测方法的应用
本研究用所建立的荧光PCR检测方法对将从门诊和猪场采集的35份疑似猪伪狂犬病病料进行检测。其中标准品扩增曲线的斜率为-3.18，R2为0.996，扩增效率为101.273。对检测结果进行分析发现，有2份样品的CT和拷贝数均在检测限内，判定为阳性，其他33份样品的CT超出检测限，或者拷贝数小于10拷贝，或者两者均在检测限外，判定为阴性。与此同时，笔者用上海之江和洛阳莱普生公司生产的试剂盒作对比，发现三者之间的符合率达到100%。3 讨论与结论
实时荧光定量PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展起来的一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、定量准确的检测技术，它克服传统PCR假阳性高和定量不准确等缺点，已成为病原学检测中重要的方法[5-6]。本研究所建立的荧光PCR检测方法能够实现对猪伪狂犬病毒的定量检测。相关研究表明，荧光定量PCR扩增产物多在100～200 bp，一般不超过300 bp[7]，本研究设计的引物扩增片段大小为165 bp，扩增片段适中，有利于提高该检测方法的效率。本研究所建立的荧光PCR方法以構建的重组质粒为标准品，将标准品进行梯度稀释，每个梯度间的间距均匀，标准曲线R2值均在0.99以上，扩增效率在90%～110%之间，说明所测结果的准确性较高。此外，对建立的荧光检测方法进行灵敏性、特异性和重复性试验，结果显示，本研究建立的检测方法灵敏度可以达到10拷贝/μL;对猪瘟、猪蓝耳、猪圆环、口蹄疫等病毒均无交叉反应现象，充分证明了该检测方法具有良好的特异性;不同稀释度的模板进行批内和批间试验，其CT值变异系数均不超过5%，说明其重复性比较好。用本研究建立的荧光PCR检测方法和购买的2个商家试剂盒对临床35份样本同时进行检测，发现3种检测结果的符合率为100%。本研究所建立的猪伪狂犬病荧光定量PCR方法为规模化猪场猪伪狂犬病的快速检测奠定了基础，为笔者所在实验室病原学检测标准的制定提供了参考依据。
参考文献：
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