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摘要：本研究根据番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV）保守N基因（GenBank登录号： 13YV639）设计一对特异性引物，通过优化反应条件和反应体系，构建了TZSV的SYBR Green RT-qPCR检测方法。该方法稳定可靠，组内和组间的变异系数都小于2%；标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.39和0.996，扩增效率为97.44%；最低能检测到1.07×104 copies/μL的阳性质粒，灵敏度为常规PCR的1 000倍。同时利用构建的RT-qPCR方法检测TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV四种病毒，只有TZSV有特异扩增曲线，表明该方法特异性良好。本研究构建的RT-qPCR方法能够为TZSV的早期预警与动态监测提供可靠的技术支撑。
关键词：番茄环纹斑点病毒；实时荧光定量 PCR；检测方法
中图分类号：S41-30：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0139-06
Abstract The real-time PCR specific primers were designed according to the coat protein N gene sequence （GenBank accession number 13YV639） of Tomato zonate spot virus （TZSV）. By optimizing the reaction conditions and reaction system， the SYBR Green real-time PCR method was established to detect the TZSV. This method was stable and reliable， and the CV between and among groups were both less than 2%. The slope and correlation coefficient of the standard curve were -3.39 and 0.996 respectively， and the amplification efficiency was 97.44%. The positive plasmid of 1.07×104 copies/μL could be detected， and the sensitivity was 1 000 times of conventional PCR. When TSWV， TNSaV， PCSV and TZSV were detected by the method， only TZSV had a specific amplification curve， which indicated that the method was specific. This research would provide technical supports for the early warning and dynamic monitoring of TZSV.
Keywords Tomato zonate spot virus； Real-time fluorescence quantitative PCR； Detection method
番茄環纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV）属于布尼亚科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）。2008年，TZSV首次在云南辣椒上发现[1]，随后在鸢尾上也有报道[2]。该病毒是RNA病毒，其基因组由三条RNA链组成：ssRNA-L、ssRNA-M和ssRNA-S。其中，ssRNA-L是反向负义链，编码依赖RNA的RNA酶；ssRNA-M编码非结构蛋白NSm；ssRNA-S编码非结构蛋白NSs。感染TZSV后的植物，新叶上首先出现黄色同心环纹或环形带状褪绿斑点，之后由黄斑转变为枯斑，叶片出现黄化、凋零，造成整叶或半叶呈红褐色坏死；受病植株还会出现矮化、顶芽萎蔫下垂、叶片皱缩退绿等症状，严重者在几周内就会死亡从而导致绝收[1，3]，对云南地区的辣椒、番茄、烟草等经济作物造成严重损失[1，3-5]。目前，TZSV只在我国云南红河、文山、石林等地有报道，是云南地区的优势种[1，4]，还未扩散至其他省市地区，因此对TZSV的预防尤为重要。
TZSV主要是由蓟马传播。本课题组前期调查发现，发病区西花蓟马（Franiklinella ocicdentalis）是优势种群，此外还发现有棕榈蓟马（T. palmi）、梳缺花蓟马（F. shculetzi ）[4，6]，推测这三种蓟马均能传播该病毒。目前对于TZSV病害尚无有效的防治手段，建立TZSV的早期诊断技术，加强对TZSV的预警与监测，在早期能及时发现并及早采取有效控制措施，对延缓病情的蔓延具有重要意义。目前，酶联免疫吸附（ELISA）和常规PCR技术是病毒病的主要检测手段。但这两种检测技术都存在不足：前者检测灵敏度低，特异性差；后者不能对病毒准确定量分析。实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）技术既能准确快速检测病毒，还可对病毒进行定量分析[7，8]。与TaqMan RT-qPCR相比，基于SYBR Green Ⅰ的RT-qPCR测定具有成本低、易于设计、更灵敏和产生线性图等优点[9]。迄今为止还没有将基于N基因的SYBR Green RT-qPCR技术用于TZSV分子诊断的报道。本研究针对TZSV的N基因设计用于RT-qPCR检测的引物，构建了TZSV RT-qPCR检测方法，拟为TZSV的流行检测提供技术手段。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
辣椒为遵辣1号，种子由贵州省遵义市农业科学院提供，栽培于玻璃温室中，培养条件：温度24～26℃，湿度60%，光周期16 h。辣椒褪绿斑病毒（Pepper chlorotic spot virus， PCSV） 、番茄坏死斑点相关病毒（Tomato necrotic spot-associated virus， TNSaV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV）和番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV）由本实验室保存。
Tripure Isolation Reagent RNA提取液和FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）试剂盒购自Roche（德国）（以下简称MIX）；RT-PCR反转录试剂盒（Trans）、质粒DNA提取试剂盒（Trans）、dNTP和Taq酶均购自TaKaRa（日本）；超微量紫外可见分光光度计（Thermo Nandrop 2000）购自美国。
1.2 病毒接种
将保存于-80℃冰箱的TZSV、PCSV、TSWV和TNSaV接种于幼嫩的辣椒叶片上。步骤如下：采集发病叶，加入接种缓冲液研磨直至汁液溢出，用棉签蘸取少量病样汁液，在洒了少许金刚砂的待接种辣椒叶面上摩擦2～3次，15～20 min后用清水冲洗叶片。
1.3 引物设计与合成
根据GenBank中登录的TZSV N基因序列（登录号：13YV639），设计TZSV N基因的特异性引物TZSV-Q-3F：5′-ATGAGGAGAACAAGGCTAA-3′、TZSV-Q-3R：5′-GAATGTCAGTCTGTAGCA-3′，并送Invitrogen公司合成。RT-PCR及实时荧光定量PCR均可采用此引物。
1.4 病毒RNA提取及反转录
称取约0.1 g感染TZSV的辣椒叶片，根据TriPure Isolation Reagent提取液说明书提取植物总RNA，溶于30 μL RNase-free Water中。用超微量紫外可见分光光度计检测其在260、280 nm处的吸光度，评估RNA质量。将质量合格的RNA于-80℃保存备用。
利用反转录试剂盒（Trans）将RNA反转录成cDNA，保存于-20℃备用。
1.5 目的基因扩增
利用设计的引物，以反转录的cDNA为模板扩增TZSV N基因。
PCR体系：5 μL cDNA，2 μL引物（浓度10 μmol/L，反向和正向各1 μL），36.5 μL水，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.5 μL Taq酶（5 U/μL）和5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）。
PCR扩增条件：94℃ 预变性4 min；94℃ 30 s，62℃ 15 s，72℃ 15 s，30个循环；72℃延伸5 min。
PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统（Genegenius，美国）拍照观察，并将目的片段胶回收测序。
1.6 实时荧光定量PCR方法的建立
1.6.1 TZSV病毒质粒的制备 将胶回收后的产物用pMD18-T载体连接转入大肠杆菌，37℃培养12 h，提取质粒DNA。利用超微量紫外可见分光光度计（Thermo Nandrop 2000）检测质粒浓度（OD260/OD280和OD260/OD230），并计算拷贝数。再将质粒梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，以此作为TZSV阳性检测标准品。
1.6.2 荧光定量PCR反应体系及条件 以TZSV标准质粒DNA为模板，构建标准曲线。反应体系为：1 μL模板、上下游引物各1 μL（浓度为10 μmol/L）、10 μL MIX和8 μL RNase-free Water。反應条件为：95℃预变性10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环；熔解曲线条件为：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。
1.6.3 重复性试验 以4组标准质粒DNA（浓度梯度10-2、10-3、10-4和10-5）为模板，同一浓度做3次重复，分析组内差异；以4组标准质粒DNA（浓度梯度10-2、10-3、10-4和10-5）为模板重复3次独立试验，分析不同批次试验之间的重复性。
1.6.4 灵敏度试验 将标准质粒DNA稀释9个浓度梯度（10-2～10-10），用实时荧光定量PCR和常规PCR扩增，以检测实时荧光定量PCR的灵敏度。
1.6.5 特异性试验 将含有TSWV、TNSaV、PCSV、TZSV病毒的辣椒叶片各称取0.1 g，分别提取总RNA后，采用上述构建的RT-qPCR技术检测，以验证所构建的RT-qPCR方法的特异性。
1.6.6 实时荧光定量PCR的初步运用 分别用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR检测实验室摩擦接毒辣椒样品，比较三种方法的差异，以检验构建的RT-qPCR方法的实用性。
2 结果与分析
2.1 目的基因获得及标准质粒DNA的制备
利用特异引物扩增TZSV的N基因片段（图1），胶回收后连接到pMD18-T质粒上，转入大肠杆菌后测序。测序结果与NCBI数据库比对，一致性为98%，序列全长164 bp。
提取大肠杆菌中的质粒DNA，用超微量紫外可见分光光度计（Thermo Nandrop 2000）检测质粒浓度及质量（表1），浓度为163.4 ng/μL，纯度符合RT-qPCR标准样品的要求。根据公式计算出标准质粒的拷贝数为1.07×1012 copies/μL。
2.2 标准曲线的建立
以10倍梯度稀释的标准质粒DNA（1.07×1011 ～1.07×107 copies/μL）为模板进行RT-qPCR扩增，得到RT-qPCR的擴增曲线和标准曲线Y= -3.39X+23.10（R2=0.996）。计算可得扩增效率为97.44%，且标准曲线中Ct值和质粒DNA拷贝数间呈现良好的线性关系（图2、3）。
2.3 重复性试验
以1.07×1010 ～1.07×107 copies/μL 4个稀释梯度的标准质粒DNA进行实时荧光定量PCR，同一个试验中，每个稀释度重复3次，组内3次结果（表2）表明，4组不同稀释浓度的标准质粒DNA Ct值的变异系数为0.20%～0.48%；再以同一浓度的标准质粒DNA为模板进行3次独立的重复试验，结果（表3）表明，组间变异系数小于2%。组内组间变异系数均在可变范围内，说明该方法稳定可靠。
2.4 灵敏度试验
分别用RT-qPCR与常规PCR检测稀释不同倍数的标准质粒（1.07×1010 ～1.07×102 copies/μL），发现常规PCR检测范围为1.07×1010 ～1.07×107 copies/μL （图4），而RT-qPCR在1.07×104 copies/μL仍能得到良好的扩增曲线（图5），说明RT-qPCR的灵敏度比常规PCR高103倍左右。
2.5 特异性试验
为验证本方法的特异性，利用RT-qPCR分别检测辣椒中的TSWV、TNSaV、PCSV和TZSV。结果表明，TSWV、TNSaV和PCSV都未出现良好的扩增曲线，只有TZSV出现良好的扩增曲线（图6），表明本研究所构建的检测方法具有良好的特异性。
2.6 荧光定量PCR的初步运用
分别用DOT-ELISA、RT-PCR 和RT-qPCR检测实验室摩擦接毒辣椒样品，结果表明，检测的6份样品中，DOT-ELISA和RT-PCR检测出2个阳性样品，而RT-qPCR检测出4个样品呈阳性（表4），说明RT-qPCR灵敏度高于DOT-ELISA和RT-PCR。
3 讨论与结论
随着社会科技的发展，病毒检测手段也越来越多，如血清免疫学和生物学技术。血清学包括Immuno Strip和ELISA法；生物学技术主要利用特异性引物或者简并性引物进行RT-PCR扩增[10，11]，之后再利用分子克隆技术进行测序、序列比对分析。郑宽瑜等[12]通过构建TZSV NSs血清，应用ELISA法检测植物中的TZSV。血清学虽能快速检测病毒，但这种方法缺点明显。张等[13]发现， INSV感染的文心兰（Oncidium luridum）样品ELISA检测结果为阴性，但RT-PCR检测结果为阳性，表明植物中INSV分布不均匀，应用ELISA 检测会造成误差，ELISA 法不能准确检测低浓度的INSV。
实时荧光定量PCR是近年来比较流行的检测手段，由于其灵敏度高、特异性强的特点越来越受到关注，已广泛运用于医学、生命科学、海关检疫等领域，如甘薯退绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）[14]、小反刍兽疫病毒（Pestedes petits ruminants virus，PPRV）[15]、禽脑脊髓炎病毒（Avian encephalomyelitis virus，AEV）的检测[16]。实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；染料类如SYBR Green Ⅰ则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者操作简便易行，成本较低。
实时荧光定量PCR与常规PCR相比具有许多优点。首先，实时荧光定量PCR使用新的温度控制机制，显著减少扩增时间。其次，常规PCR扩增后电泳和染色步骤耗时、污染环境，对人体有害。第三，实时荧光定量PCR方法数据分析快速且具有良好的再现性，可以同时进行96个样品的数据分析，高效快速。本试验根据TZSV N基因的保守区设计特异性引物，构建了TZSV N基因的实时荧光定量PCR检测方法。该方法的灵敏度、重复性、特异性良好，能用于检测实验室接毒辣椒样品。该检测方法的构建将为早期TZSV的传播、蔓延提供可靠的预测预报手段。
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