[摘要] 目的 探讨结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）在肺结核和肺外结核诊断中的应用价值。 方法 选取2014年6月～2017年6月于上海交通大学附属第六人民医院南院住院治疗的疑诊为活动性肺结核和肺外结核的患者200例，进行外周血T-SPOT.TB、皮肤结核菌素试验（PPD）和萋-尼抗酸染色（AFB）的检测，并比较3种方法的诊断价值。 结果 T-SPOT.TB、PPD和AFB试验诊断结核病的敏感性、特异性、阴性预测值及精准度比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;T-SPOT.TB诊断肺结核的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及精准度高于PPD和AFB（P < 0.05）;T-SPOT.TB诊断肺外结核的敏感性、阴性预测值及精準度均高于PPD和AFB（P < 0.05），而PPD与AFB比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 T-SPOT.TB诊断肺结核和肺外结核具有较高敏感性和特异性，是快速诊断结核感染的有效手段，值得临床应用推广。
[关键词] 结核感染T细胞斑点试验;肺结核;肺外结核
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0157-05
结核病一直是危及人类健康的重大传染病，我国是全球22个结核病高负担国家之一，目前我国结核病年发病人数约为130万，位居全球第2位[1]。肺外结核是指发生在肺部以外各部位结核病，可表现为多系统、多部位、多脏器、多类型的结核，临床表现多样，缺乏特异性，临床诊断较肺结核更具有难度，容易漏诊和误诊[2]。目前，诊断结核的主要方法包括抗酸染色、结核杆菌培养、病理学检查和皮肤结核菌素试验（PPD）等，存在检出率低、耗时长、有创伤、影响因素广泛等局限性，对临床诊断结核帮助有限[3-4]。结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是近年来一种新的结核病诊断方法，具有异性好、灵敏度高、快速简便、耗时少等特点[5]。国外研究已证明T-SPOT.TB对肺结核和肺外结核诊断具有明显的效果，但国内尚缺乏相关的临床研究，尤其是肺外结核[6-7]。因此，本研究以活动性肺结核和肺外结核患者为研究对象，观察T-SPOT.TB的诊断效能，探讨T-SPOT.TB在肺结核和肺外结核诊断中的应用价值，旨在寻找快速、准确地结核病诊断方法。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年6月～2017年6月于上海交通大学附属第六人民医院南院（以下简称“我院”）住院治疗的疑诊为活动性肺结核和肺外结核的患者200例，其中男121例，女79例，年龄34～76岁，平均（57.43±8.50）岁，均经结核杆菌培养、组织病理结果、医学影像学结果及临床症状明确诊断。最终确诊结核患者127例，非结核患者73例，结核患者包括肺结核为63例，肺外结核64例，其中肺外结核包括结核性胸膜炎48例、骨结核7例（包括胸椎、腰椎）、结核性腹膜炎3例、淋巴结核2例，泌尿系结核2例，淋巴性脑膜炎1例，附睾结核1例。纳入标准：合并咳嗽、咳痰、咳血、消瘦、低热、乏力等体征和症状;检查胸片时存在肺结核典型改变，检查痰涂片时存在呈阳性的抗酸杆菌;穿刺检查胸腔积液时，渗出液为穿刺液，且在液体标本中存在较多的淋巴细胞;通过抗结核治疗后，临床疗效显著，但是抗炎治疗的临床效果不显著。排除标准：肺结核复治者或初治≥2周者;存在急性病毒性感染、获得性免疫缺陷综合征、矽肺、糖尿病、肿瘤或其他会导致免疫功能异常的疾病;人免疫缺陷病毒检测抗体阳性。本研究已通过我院医学伦理委员会审核，患者均知情同意。
1.2 方法
1.2.1 T-SPOT.TB检测方法 ①实验步骤：整个实验过程严格按照试剂盒（oxford immunotec ltd，UK）说明书操作。采集外周血5 mL，采用密度梯度离心法分离制备外周单个核细胞，并移至洁净离心管中，无血清培养液AIM-V洗涤细胞，去除内源性γ干扰素（IFN-γ）。制备250万细胞/mL的标准细胞稀释液，取出培养板，标记并依次加入AIM-V无血清培养液50 μL、抗原A50 μL，抗原B50 μL和阳性对照50 μL，并每孔加入100 μL含25万PBMC的细胞稀释液。将培养板放入37℃，5%CO2培养箱中孵育16～20 h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤4遍，各孔内加入新鲜配制的酶标抗体溶液50 μL，4℃孵育1 h。再采用PBS洗涤4遍，酶联显色，干燥培养板。ELISPOT自动计数仪下对斑点进行计数。②结果判定[8]：当阴性对照孔斑点数为0～5，阳性样本应为：（抗原A或抗原B斑点数）-（阴性对照孔斑点数）≥6;当阴性对照孔斑点数≥6，阳性样本应为（抗原A或抗原B斑点数）≥2 ×（阴性对照孔斑点数）。
1.2.2 萋-尼抗酸染色法（AFB）和PPD AFB参照张娴[9]的方法。PPD采用0.1 mg含5 μl结核菌素，并在72 h后观察结果。一般阳性反应为硬结直径≥5 mm，强阳性反应为硬结直径≥10 mm表示结核感染。
1.3 判定标准
以最终诊断结果为标准，计算T-SPOT.TB、AFB及PPD诊断肺结核和肺外结核的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及精确度。敏感性为真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）×100%;特异性为真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）×100%;阳性预测值为真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）×100%;阴性预测值为真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）×100%;精确度为[真阳性数+真阴性数/（真阳性数+假阳性数+真阴性数+假阴性数）×100%]。
1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同方法鉴别诊断结核病的效能比较
T-SPOT.TB诊断为结核病患者135例，其中，最终确诊者115例;诊断为非结核病患者65例，其中53例被最终确诊;PPD诊断为结核病患者132例，其中，最终确诊者101例，诊断为非结核病患者68例，其中42例被最终确诊;AFB诊断为结核病患者132例，其中，最终确诊者85例，诊断为非结核病患者68例，其中26例被最终确诊。T-SPOT.TB诊断结核病的敏感性、特异性、阴性预测值及精准度均高于AFB和PPD（P < 0.05）。見表1。
2.2 不同方法鉴别诊断肺结核和肺外结核的效能比较
T-SPOT.TB诊断为肺结核患者和肺外结核患者分别为65例和62例，最终确诊肺结核患者和肺外结核患者分别58例和57例;PPD诊断为肺结核患者和肺外结核患者分别为70例和57例，最终确诊肺结核患者和肺外结核患者分别50例和48例;AFB诊断为肺结核患者和肺外结核患者分别为65例和62例，最终确诊肺结核患者和肺外结核患者分别45例和44例。T-SPOT.TB诊断肺结核的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及精准度均高于PPD和AFB（P < 0.05）。见表2。T-SPOT.TB诊断肺外结核的敏感性、阴性预测值及精准度均高于PPD和AFB（P < 0.05），而PPD与AFB比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。
3 讨论
3.1 目前我国结核病诊断现状
痰涂片结核菌AFB和PPD是我国目前最主要的结核病检测方法。在无法进行分枝杆菌培养的情况下，痰涂片结核菌AFB可谓诊断肺结核的“金标准”，但是其结果的判断受到检测者涂片质量、染色时间、阅镜经验等主观因素影响，同时还受到疾病所处的时期有关，故假阳性率高、漏诊率较大[9-10]。PPD的灵敏度水平受患者免疫力状况、营养状况、卡介苗接种等多种因素影响，假阳性率较高，大大影响了其临床应用价值[11]。在本研究中，PPD和AFB对结核病的敏感性分别为79.53%、66.93%，而进一步细化观察发现，对肺结核的敏感性分别为79.37%、71.42%，对肺外结核的敏感性为75.00%，66.67%，与其他研究结果类似，提示痰涂片结核菌AFB和PPD在临床中诊断结核病的应用价值都比较低[12-14]。
3.2 T-SPOT.TB在结核病诊断中具有较高的应用价值
近年来，随着免疫学检测技术的不断发展，以酶联免疫斑点技术（ELISPOT）为检测方法的结核感染T细胞检测方法（T-SPOT.TB）作为一种新的结核病诊断方法逐渐建立并发展起来，被广泛的应用于结核感染筛查[15-16]。感染结核分枝杆菌的机体存在结核特异性记忆T淋巴细胞，当再次遇到结核特异性抗原刺激时，转化为效应T淋巴细胞，释放IFN-γ，靶抗原6（ESAT-6）和过滤蛋白10（CFP-10）是结核分枝杆菌复合群基因RD1区域rv3875和rv3874编码的结核特异性蛋白抗原，可从MTB感染者的T细胞中诱导出较强的IFN-γ释放反应，根据以上原理而设计的T-SPOT.TB技术是目前最敏感的检测结核抗原特异性T淋巴细胞的技术[17-18]。在本研究中，T-SPOT.TB诊断结核病的敏感性、特异性及精准度分别为90.55%（115/127）、72.60%（53/73）、84.00%（168/200），均明显高于AFB和PPD（P < 0.05），提示T-SPOT.TB对结核病的诊断具有较好的效果。
3.3 T-SPOT.TB对肺结核和肺外结核均具有较好的诊断效能
本研究发现，T-SPOT.TB诊断肺结核的敏感性、特异性、阳性预测值及精准度高于PPD和AFB（P < 0.05）。班丽芳[19]研究发现，T-SPOT.TB诊断肺结核的的准确率明显高于PPD。阚景双等[20]研究发现，T-SPOT.TB诊断肺结核的敏感性为95.1%，高于包括PPD，血清结核杆菌抗体、痰涂片结核分枝杆菌检测以及支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌检测在内的其他各项检查方法。肺外结核的临床表现与多种疾病的表现类似，多在体内较深或隐匿部位，不易获得细菌学及病理学证据，有些需手术或穿刺活检确诊，但需考虑患者经济原因及其依从性，很多患者不能接受，诊断难度高于肺结核。因此，肺外结核误诊、漏诊极为常见，常因此而延误治疗，严重影响患者预后。一项在疑诊肺外结核患者中进行的前瞻研究发现，33%伴有免疫功能不全，免疫功能不全的患者中PPD皮试灵敏度仅有38%，而免疫功能正常患者中为69%[21]。本研究发现，T-SPOT.TB诊断肺外结核病的灵敏性为89.06%，高于AFB和PPD（P < 0.05）。T-SPOT.TB的优势在于不受患者免疫力状态和排菌期、排菌量的影响[22-23]。研究显示，通过使用结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌ESAT-6和培养CFP-10刺激结核感染后T淋巴细胞，分泌的特异性的细胞因子IFN-γ，并通过ELISPOT技术，应用T-SPOT.TB实验检测血液中有无INF-γ，从而可以判断有无结核分枝杆菌的感染，不仅灵敏度高、特异性强、而且操作简单、耗时少，一般1～2 d就能看到结果[24-25]。
综上所述，T-SPOT.TB诊断肺结核和肺外结核具有较高敏感性和特异性，是快速诊断结核感染的有效手段，值得临床应用推广。
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（收稿日期：2018-06-01 本文編辑：封 华）