[摘要] 目的 评价结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）检测胸腔积液和外周血对结核性胸膜炎（TBP）的诊断价值。方法 前瞻性纳入2013年6月～2015年8月潍坊市人民医院疑诊为结核性胸腔积液患者84例，分离患者胸腔积液单个核细胞（PEMCs）及外周血单个核细胞（PBMCs）进行T-SPOT.TB检测。比较两种标本MTB特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后斑点形成细胞（SFCs）数量及其诊断特性，SFCs数量均值采用中位数（M）或四分位数间距（P25，P75）表示。 结果 根据临床诊断和分组标准，最终诊断TBP患者48例，非结核性胸膜炎（NTBP）患者36例；PBMCs和PEMCs T-SPOT.TB检测诊断TBP的灵敏度为81.3%和97.9%（P < 0.05），特异性为88.9%和80.6%（P > 0.05），阳性预测值为90.7%和 87.0%（P > 0.05），阴性预测值为78.1%和97.6%（P < 0.05）。TBP患者PEMCs标本中ESAT6和CFP10的SFCs分别为1350（103.3，2750.0）、757.5（51.3，2512.5），PBMCs中分别为49.0（5.0，420.0）、39.5（4.3，390.5），PEMCs标本中形成的斑点数量显著高于PBMCs标本（4～15倍）（Z = 4.7，P < 0.05；Z = 4.3，P < 0.05）。 结论 PEMCs T-SPOT.TB检测对诊断TBP的灵敏度和阴性预测值高于PBMCs，但特异性和阳性预测值低于PBMCs，PEMCs和PBMCs同步检测临床诊断价值更大。
[关键词] 结核性胸膜炎；结核感染T细胞斑点试验；胸腔积液；外周血；诊断价值
[中图分类号] R521 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（a）-0125-04
[Abstract] Objective To investigate the diagnostic accuracy of T-cell enzyme-linked immunospot assay （T-SPOT.TB） on pleural effusion and peripheral blood for patients with tuberculous pleurisy （TBP）. Methods A total of 84 patients with clinically suspected TBP admitted from June 2013 to August 2015 in Weifang People"s Hospital were eolled in this prospective cohort study and examined with T-SPOT.TB on pleural effusion mononuclear cells （PEMCs） and peripheral blood mononuclear specific T cell sensitization nucleus cells （PBMCs） simultaneously. Cell numbers of spot forming cells （SFCs） formed after stimulated by MTB specific antigen ESAT-6 and CFP-10 in the two specimens and its diagnostic features were compared， average number of SFCs was expressed by median （M） and interquartile range （P25， P75）. Results According to the standard of diagnosis of TBP and grouping， 48 patients were diagnosed with TBP， and 36 cases of the non-TBP （NTBP）. The sensitivities of T-SPOT.TB on PBMCs and PEMCs for the diagnosis of TBP were 81.3% and 97.9%， respectively （P < 0.05）， and the positive prediction values were 90.7% and 87.0 % （P > 0.05）. The specificities of T-SPOT.TB on PBMCs and PEMCs for the identification of NTBP were 88.9% and 80.6%， respectively （P > 0.05）， and the negative prediction values were 78.1% and 97.6% （P < 0.05）. Numbers of SFCs of the early secretory antigenic target 6 （ESAT-6） and CFP-10 in samples of patients with TBP were 1350 （103.3， 2750.0）， 757.5 （51.3， 2512.5） on PEMCs and 49.0 （5.0， 420.0）， 39.5 （4.3， 390.5） on PBMCs respectively， numbers of SFCs of the ESAT-6 and CFP-10 on PEMCs samples of patients with TBP were significantly higher （4-15 times） than that on PBMCs samples （Z = 4.7， P < 0.05； Z = 4.3， P < 0.05）， Conclusion PEMCs T-SPOT.TB assay has highly sensitivity and negative prediction value for diagnosis of TBP， but PBMCs T-SPOT.TB has highly specificity and positive prediction value. Both PEMCs and PBMCs T-SPOT.TB assay simultaneously have a greater clinical diagnostic value for TBP.
[Key words] Tuberculous pleurisy； T-cell enzyme-linked immunospot assay； Pleural effusion； Peripheral blood； Diagnostic value
结核性胸膜炎（tuberculous pleurisy，TBP）是一种常见的肺外结核，约占渗出性胸腔积液病因的54.8%[1]，结核分枝杆菌直接侵入胸膜或经淋巴管血行播散至胸膜是该病的主要发病机制。TBP缺乏特异性临床表现，早期诊断存在一定难度，传统的实验室诊断方法阳性检出率低[2-3]，胸膜活检因有创伤性难以广泛应用。结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是近年来发展起来的一种诊断结核病的细胞学检测技术，它是应用MTB特异性抗原（ESAT-6、CFP-10）体外刺激单个核细胞，通过检测分泌γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）的特异性致敏T细胞数量来判断是否存在结核菌感染，不受卡介苗接种和非结核分枝杆菌的影响，其敏感性和特异性均高于其他常规检测方法[4-5]。本研究应用T-SPOT.TB技术检测胸腔积液单个核细胞（Pleural effusion mononuclear cells，PEMCs）和外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中效应T细胞数量，评价PBMCs和PEMCs标本T-SPOT.TB检测对TBP的临床诊断价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性纳入2013年6月～2015年8月潍坊市人民医院呼吸内科、胸外科、肿瘤内科和消化内科住院疑诊TBP患者84例，其中男53例，女31例，年龄18～84岁。根据患者临床表现、病史及合并症、影像学、细菌学和组织病理学检查、胸水常规、生化、癌胚抗原等检查，以及抗结核治疗反应，对所有病例进行诊断评估，研究对象均无艾滋病毒感染和严重的肝肾功能损伤。按照最终是否诊断为TBP分为TBP组和非TBP（NTBP）组。
1.2 诊断标准
1.2.1 TBP诊断标准 ①实验室诊断：有细菌学和病理学诊断证据，如胸腔积液结核杆菌培养阳性，胸膜病理活检发现干酪样坏死等结核典型改变。②临床诊断：有结核病史；有相应的临床表现，如发热、盗汗、疲乏、刺激性干咳、胸痛等；穿刺胸腔积液为渗出液，其中淋巴细胞增多；腺苷脱氨酶活性增高；未见肿瘤细胞，且各项肿瘤标志物阴性；结核菌素试验强阳性；常规治疗无效，经抗结核治疗2～4周好转，最终确诊[6]。
1.2.2 NTBP诊断标准 临床排除结核病，并已确诊为其他疾病，随访1～3个月无结核病表现者。
1.3 方法
1.3.1 外周血T-SPOT.TB检测 采集静脉血5 mL于肝素抗凝管，充分混匀，送检；淋巴细胞分离液分离PBMSCs，最后用AIM-V配制0.5 mL含有2.5×105/mL PBMCs的细胞悬液，每份标本设阴性、A、B和阳性4个孔，分别加入AIM-V培养基、A抗原、B抗原和阳性对照各50 μL，每孔加稀释好的PBMCs细胞悬液各100 μL，置37℃ 5%CO2培养箱孵育16～20 h，PBS洗板4次；然后每孔加入碱性磷酸酶标记的二抗，2～8℃孵育1 h；PBS洗板，加底物后常温避光显色7 min，蒸馏水终止反应；37℃恒温箱干燥10 min，显微镜下计数IFN-γ斑点形成细胞（SFCs）数量。
1.3.2 胸腔积液T-SPOT.TB检测 收集新鲜胸腔积液20～25 mL（肝素钠抗凝），PEMCs分离、检测和SFCs计数同PBMCs方法。
1.3.3 T-SPOT.TB判断标准 当阴性孔斑点数为0～5个时，A或B孔斑点数减去阴性孔斑点数≥6个为T-SPOT.TB阳性；当阴性孔斑点数为6～10个时，A或B孔斑点数≥2倍阴性孔斑点数为T-SPOT.TB阳性；同时阳性孔斑点数≥20个。
1.4 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布计量资料的均数用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；不符合正态分布的改用中位数（M）或四分位数间距（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验（秩和检验）。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 诊断情况
根据分组标准，结合其他检查指标和随访结果，最终TBP组患者48例，其中男29例，女19例；年龄18～84岁，单纯性胸膜炎39例（81.3%），合并陈旧性肺结核4例（8.3%），合并免疫系统疾病2例（4.2%），合并高血压1例（2.1%），合并肝硬化1例（2.1%），合并心包积液1例（2.1%）。NTBP组患者36例，其中男24例，女12例；年龄22～82岁；恶性肿瘤20例（55.6%），肺炎旁胸腔积液2例（5.6%），甲亢2例（5.6%），糖尿病7例（19.4%），特发性肺间性肺炎1例（2.8%），心包积液2例（5.6%），结缔组织病1例（2.8%），肝功能不全1例（2.8%）。
2.2 PEMCs和PBMCs两种标本T-SPOT.TB试验对诊断TBP特性的比较
两种特异性抗原ESAT6和CFP10联合（ESAT6+CFP10）检测，PEMCs T-SPOT.TB试验诊断TBP的灵敏度和阴性预测值显著高于PBMCs（均P < 0.05），但特异性和阳性预测值比较差异无统计学意义（均P > 0.05）。TBP组中，1例患者PEMCs T-SPOT.TB检测结果阴性，ESAT6和PCFP10的SCFs数量均为0，而其PBMCs的T-SPOT.TB检测结果均为阳性，ESAT6和PCFP10的SCFs分别为72、23个。PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10单抗原刺激SFCs数量对诊断TBP的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值比较差异均无统计学意义（均P > 0.05）；PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10单抗原刺激SFCs数量对诊断TBP的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值比较差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表1。
2.3 PBMCs和PEMCs标本MTB特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激SFCs数量比较
TBP患者组胸腔积液PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10中SFCS数量显著高于外周血PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10的SFCs数量，为4～15倍（均P < 0.05），SFCs的M值分别为1350.0、757.5和49.0、39.5；NTBP组胸腔积液PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10形的斑点数量成与外周血PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10斑点数量比较差异无统计学意义（均P > 0.05），SFCs的M值分别为1、0和0、0。TBP组外周血PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10组SFCs显著高于NTBP组（均P < 0.05），TBP组胸腔积液PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10形成的SFCs也显著高于NTBP组（均P < 0.05）。见表2。
3 讨论
结核性胸膜炎病情隐匿，缺乏特异性临床表现，极易造成误诊漏诊[7-10]。建立快速、准确的诊断方法，是及时治疗和控制结核病蔓延的关键。MTB感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞，当再次遇到MTB特异性抗原时能迅速活化增殖，并释放IFN-γ。T-SPOT.TB技术通过检测产生IFN-γ的效应T细胞数量，不受BCG接种和大多数环境中的非MTB影响，在诊断MTB潜伏感染（LTBI）具有较高的敏感性和特异性[11-12]。Li等[13]应用Meta分析，纳入的9项研究对T-SPOT.TB试验诊断TBP的综合灵敏度为93%，特异性为90%，认为T-SPOT.TB试验是诊断TBP的一种有效方法。T-SPOT.TB在不同临床表现的肺外结核中其诊断性能不一样，呈慢性经过表现的肺外结核敏感性较高（95%CI：83%～97%），对结核性脑膜炎和粟粒性肺结核的诊断敏感性较低（95%CI：66%～87%）[14]，即使在免疫力低下的HIV阳性结核患者中，T-SPOT.TB也仍然具有较高的敏感性（90%）[15]。近年来，关于T-SPOT.TB诊断TBP的研究报道较多[4，6，11，14，16-18]，但因纳入的研究病例数、既往结核感染史、临床表现等因素的影响，其敏感性和特异性有较大差异，敏感性在71%～96%，特异性为60%～100%。Lee等[16]报道，胸腔积液和外周血T-SPOT.TB诊断TBP的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为94.7%、85.7%、85.7%、94.7%和77.8%、90.5%、87.5%、82.6%，认为T-SPOT.TB能准确地诊断结核性胸膜炎，更适合于不能做胸膜活检或胸膜活检阴性患者的诊断。王美芳等[17]报道，胸腔积液和外周血T-SPOT.TB对诊断TBP的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为94.4%、95.4%、97.1%、91.3%和83.3%、90.9%、93.7%、76.9%。本研究结果显示，PEMCs T-SPOT.TB对诊断TBP的灵敏度和阴性预测值（97.9%和97.6%）显著高于PBMCs（81.3%和78.1%）（P < 0.05），特异性和阳性预测值（80.6%和87.0%）则低于PBMCs（88.9%和90.7%）（P > 0.05），与Lee等[16]的研究结果基本一致。TBP组中1例患者PEMCs T-SPOT.TB结果阴性，而PBMCs T-SPOT.TB结果为阳性，抗痨治疗4个月，病人康复出院。提示PEMCs和PBMCs T-SPOT.TB检测不能相互取代，二者同步检测临床诊断价值会更大。TBP患者组PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10 组SFCs数量显著高于外周血PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10组SFCs数量（4～15倍）。这可能与急性感染期间特异性效应T细胞主要集中在感染部位，外周血中相对较少有关[16]。PBMCs-ESAT6和CFP10及PEMCs-ESAT6和CFP10单抗原刺激SFCs数量对诊断TBP的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。PEMCs T-SPOT.TB特异性和阳性预测值相对较低，可能与既往结核感染史、合并结核、LTBI、药物应用等因素相关[19-21]，本研究中7例假阳性结果，其中3例肿瘤患者既往有结核病史，2例有明确结核接触病史，1例肿瘤合并继发性肺结核，PEMCs T-SPOT.TB诊断特异性低可能与此相关。
综上所述，胸腔积液T-SPOT.TB检测与外周血比较，对诊断TBP有较高的灵敏度和阴性预测值，但特异性和阳性预测值低于外周血，对胸腔积液浑浊和/或接受胸腔局部药物灌注治疗的患者，同时检测外周血T-SPOT.TB临床诊断价值更大。
[参考文献]
[1] 孙家兴，于文成，胡海燕，等.恶性胸腔积液与结核性胸腔积液的诊断进展[J].现代生物医学进展，2013，13（14）：2780-2782，2789.
[2] 卢水华，肖和平.结核病诊断新技术及其评价[J].中国实用内科杂志，2015，8（35）：651-654.
[3] 杨泽西，张泽明，王震，等.结核性胸膜炎实验室诊断方法的研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23（8）：7-10.
[4] 曹远国，张明艳，王琨.结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验对结核性腹膜炎的诊断价值[J].中华医院感染学杂志，2015，25（18）：4116-4118.
[5] 王洁玲，唐余燕，余永胜.结核分枝杆菌蛋白抗原的研究进展[J].中国医药导报，2015，12（36）：53-56.
[6] 廖兵，丁显平.T-SPOT.TB和ADA在结核性胸膜炎中的诊断价值[J].国际检验医学杂志，2014，9（35）：2323-2325.
[7] 李亮.从临床医师的角度看结核病诊断技术[J].中华临床医师杂志，2014，8（12）：4165-4168.
[8] WHO. Global tuberculosis report 2013[C]. Geneva：WHO/IUATLD，2013.
[9] WHO. Global tuberculosis report 2014[C]. Geneva：WHO/IUATLD，2014.
[10] Einat Fireman-Klein MD，Avraham Man MD，Yehuda Schwartz MD Interferon et al. Gamma release assay-guided latent tuberculosis prophylaxis in Israel[J].IMAJ，2015，7（17）：405-409.
[11] 刘涛.T-SPOT.TB技术在结核性胸膜炎诊断中的意义[J].国际检验医学杂志，2015，5（36）：1283-1284.
[12] 张瑛，孙亚蒙，徐欣晖，等.结核感染T细胞斑点试验在结核性疾病中的诊断价值[J].中华临床医师杂志：电子版，2010，4（12）：2431-2434.
[13] Li ZZ，Qin WZ，Li L，et al. Accuracy of enzyme-linked immunospot assay for diagnosis of pleural tuberculosis：a meta-analysis [J]. Genet Mol Res，2015，14（3）：11672-11680.
[14] Cho OH，Park KH，Kim SM，et al. Diagnostic performance of T-SPOT. TB for extrapulmonary tuberculosis according to the site of infection [J]. J Infect，2011，63（5）：362-369.
[15] Chapman AL，Munkanta M，Wilkinson KA，et al. Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells [J]. AIDS，2002，16（17）：2285-2293.
[16] Lee LN，Chou CH，Wang JY，et al. Enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in the diagnosis of tuberculosis pleurisy [J]. Clin Microbiol Infect，2009，15（2）：173-179.
[17] 董璇，李天兴，韩晓群，等.联免疫斑点试验诊断结核性胸膜炎的临床应用价值[J].中国医药导报，2014，11（8）：91-93.
[18] 白雪娟，梁艳，刘银萍，等.ELISPOT检测胸水γ干扰素效应T细胞对结核性胸膜炎的诊断价值研究[J].中国病原生物学杂志，2015，10（4）：299-302.
[19] Kim HJ，Yoon HI，Park KU，et al. The impact of previous tuberculosis history on T-SPOT. TB（R） interferon-gamma release assay results [J]. Int J Tuberc Lung Dis，2011， 15（4）：510-516.
[20] 孙娇，李莹，王悦，等.T-SPOT对青少年结核病诊断价值的研究[J].中国当代医药，2015，22（27）：135-136，139.
[21] 孙娇，李莹，王悦，等.103例未成年结核病患者T-SPOT结果分析[J].中国当代医药，2015，22（30）：111-113.