【摘要】 利用实时荧光定量PCR和细菌16S rRNA测定技术制备牙龈卟啉菌染色体探针，并进行检测，为进一步研究牙周病可疑致病菌提供方法。主要方法是：厌氧环境下培养牙龈卟啉菌，抽提细菌DNA；根据基因库已知牙龈卟啉菌16S rRNA DNA序列，设计特异性的TaqMan探针和一对引物；经实时荧光定量PCR仪进行细菌DNA样本的PCR反应获得反应曲线。结果表明，细菌DNA样本经PCR反应后，在15个循环时，开始出现扩增曲线，此后荧光逐渐增强，在26个循环后达峰值。由此可见，利用细菌16S rRNA技术制备致病菌染色体探针，经实时荧光定量PCR测定，可以对目标微生物进行准确定性和定量。
【关键词】 实时荧光定量PCR 牙龈卟啉菌 探针
与牙周病有关的微生物主要是牙菌斑（dental plaque），特别是龈下菌斑（subgingival plaque）中的革兰阴性专性厌氧菌和噬二氧化碳菌，如牙龈卟啉菌(porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)[1,2]。P. gingivalis是目前公认的牙周可疑致病菌，也是牙周微生物领域重点研究的厌氧菌之一[3,4]。研究认为，P. gingivalis附着于宿主组织细胞的表面是引起牙周病的先决条件[5]。准确地检测P. gingivalis对牙周病的预防、治疗和活动性监测均大有裨益。随着分子生物学和分子遗传学的持续发展，利用DNA识别微生物和测定微生物数量的技术因其特异性强、敏感性高、检测方便快捷等特点得以迅速发展。其中，16 S rRNA技术已经以其独特的优越性，开始应用于口腔微生物菌群的检测，并作为细菌分类和鉴定的“金标准”而应用于口腔细菌的研究中[6-8]。本研究的目的是采用16 S rRNA技术制备P. gingivalis染色体探针，为进一步研究P. gingivalis提供方法。
1 材料与方法
1.1菌株及细菌DNA抽提
1.1.1菌株
将P. gingivalis ATCC33277菌株（由首都医科大学口腔医学院口腔微生物实验室提供）接种于5％绵羊血厌氧基础琼脂平板上，置厌氧产气袋（法国 Biomerieux Co., Inc.）中于37℃培养箱中培养7天后收获菌落。将P. gingivalis菌落用无菌TE液配成细菌悬浊液，约106CFU ml-1备用。
1.1.2 细菌DNA的抽提
主要操作步骤如下：200μl 细菌悬浊液加400μl Cell Lysis Solution混匀，再加入6μl Proteinase K混匀，置于55℃水浴10分钟；加入600μl 氯仿小心混匀；10，000转/分室温离心2分钟后取500μl 上清于Eppendorf管中，加500μl Precipitation Solution混匀，室温2分钟后10，000转/分离心2分钟；去上清后加100μl 1.2mol/L NaCl，轻轻振荡至沉淀溶解，加300μl 冰冻乙醇，－20℃10分钟后10，000转/分离心5分钟，吸走乙醇，70％乙醇洗涤一次，倒置室温干燥10分钟；100μl TE溶解DNA待用。以上试剂皆由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
1.2 引物和探针
根据NCBI ( .cn/qkimages//chsc/chsc200708/chsc20070801-1-l.jpg" hspace="15" vspace="5" align="">
1.3 实时荧光定量PCR反应
将细菌DNA、引物（ 终浓度约500nM ）、TaqManTM 探针（终浓度约200nM ）和Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa公司提供）按规定组份（见表2）在冰上配制PCR反应液于96孔板上。细菌DNA的扩增和检测在ABI Prism7000定量 PCR 仪（美国Applied Biosystems Co.）上进行，采用两步法PCR扩增标准程序，循环参数为95℃ 预变性10 s后，95℃ 变性5 s，60℃ 退火31 s，40个循环。
2 结果
根据Real-time PCR扩增曲线原理，Baseline阶段为荧光背景信号阶段，在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。在荧光信号指数扩增阶段，即探针检测到样品DNA扩增的时候，会有荧光曲线出现，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，即出现PCR扩增曲线的时候意味着有目标DNA存在（见图2）。本实验细菌DNA样本经PCR反应后，在Ct值15时，开始出现扩增曲线，此后荧光逐渐增强，在26个循环后达峰值（见图3）。
3 讨论
实时荧光定量 PCR 技术是DNA定量技术的一次飞跃，该技术的应用近几年迅猛发展。所谓的实时荧光定量PCR就是
通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。在实时荧光定量PCR反应过程中，当反应的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值（ threshold value ）。Ct 值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图三所示），并获得曲线方程。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上或者由曲线方程计算出该未知样品的起始拷贝数[10-11]。
TaqMan TM 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。TaqMan TM 探针设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，其荧光基团连接在探针的 5" 末端，而淬灭剂则位于 3" 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3" 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5" 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量在一定范围内呈正比关系[10-11]。
细菌编码16 S rRNA基因存在于所有细菌染色体基因中，约为1500个核苷酸大小，是高度保守基因，其保守区之间存在变异区，具有种间差异的特异性。针对某种细菌16 S rRNA基因变异区设计的特异性引物，通过聚合酶链反应检测，可以将细菌进行迅速而高效的特异性鉴别，并且其敏感性明显高于传统的培养法[12]。本研究中使用的P. gingivalis ATCC 33277 菌株，其16 S rRNA基因全序列目前已经完全破译并能在PubMed基因库中查询，方便了我们设计特异性引物进行实时荧光定量PCR检测。
本实验中，实时荧光PCR检测到扩增曲线，证明了根据P. gingivalis ATCC 33277 菌株的16 S rRNA 基因序列设计出特异性引物与探针获得成功，经Real-time PCR反应，上述特异性引物与探针能够检测特异的病原菌。在今后牙周病可疑致病菌的检测中，可以利用上述方法，对致病菌进行迅速而高效的检测，并可以对目标微生物进行准确定性和定量，这将方便相关的临床和科研工作。
参考文献
[1]Potempa J, Banbula A, Travis J. Role of bacterial proteinases in matrix destruction and modulation of host responses[J]. Periodontol 2000，2000，24: 153-192
[2]Graves DT. The potential role of chemokines and inflammatory cytokines in periodontal disease progression[J]. Clin Infect Dis，1999，28(3): 482-490
[3]Chaves ES, Jeffcoat MK, Ryerson CC, et al. Persistent bacterial colonization of Porphyromonas gingivalis[J]. J Clin Periodontol，2000，27（12）: 897-903
[4]曹采方. 牙周病学第二版[M]. 北京：人民卫生出版社，2003, 5.
[5]Lindhe J, Hamp S, Loe H. Experimental periodontitis in the beagle dog[J]. J Periodontal Res，1973，8(1): 1-10
[6]Slots J, Ashimoto A, Flynn MJ, et al. Detection of putative periodontal pathogens in subgingival specimens by 16S ribosomal DNA amplification with the polymerase chain reaction[J]. Clin Infect Dis, 1995, 20（Suppl 2）: 304-307
[7]Kuboniwa M, Amano A, Kimura KR, et al. Quantitative detection of periodontal pathogens using real-time polymerase chain reaction with TaqMan probes[J]. Oral Microbiol Immunol, 2004, 19(3): 168-176
[8]Boutaga K, van Winkelhoff AJ, Vandenbroucke-Grauls CM, et al. Comparison of real-time PCR and culture for detection of Porphyromonas gingivalis in subgingival plaque samples[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(11): 4950-4954.
[9]Hiroshi M, Chiyo Fujimoto, Yasuhiro Haruki, et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQ gene and total bacteria[J]. Immunol Med Microbiol，2003，39(1):81-86.
[10]User Bulletin #2: ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. P/N 4303859B: 1-36.
[11]Mark A, Valasek, JJ Repa. The power of real-time PCR[J]. Adv Physiol Educ, 2005, 9(3): 151-159.
[12]Kuboniwa M, Amano A, Kimura KR, et al. Quantitative detection of periodontal pathogens using real-time polymerase chain reaction with TaqMan probes[J]. Oral Microbiol Immunol, 2004, 19(3): 168-176.