摘要：钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2（SNAT2）属于SLC38家族，参与小的中性氨基酸跨膜转运，在哺乳动物组织中广泛表达.SNAT2的功能紊乱可以导致许多神经性疾病，如阿尔茨海默症、帕金森症等.采用PCR方法扩增得到SNAT2氨基端75个氨基酸的编码序列，构建重组质粒pET28a-SNAT2-75aa，并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）中，通过IPTG诱导表达重组蛋白.利用组氨酸标签蛋白经镍柱亲和纯化后得到了纯度在95%以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa，将其作为免疫原免疫新西兰大白兔，从而获得 SNAT2多克隆抗体.采用巯丙基琼脂糖凝胶6B （Thiopropyl sepharose ） 固定抗原亲和纯化法进一步对该抗体进行纯化，纯化后的抗体效价至少提高10倍.蛋白免疫印迹确定该抗体对SNAT2具有高度的特异性，表明SNAT2多克隆抗体制备的成功，为进一步研究SNAT2蛋白的结构和功能奠定了生化基础.
关键词：转运蛋白； 中性氨基酸； 抗体； 蛋白纯化
中图分类号：Q 513+.2 文献标识码：A 文章编号：10005137（2013）05048106
0 引 言
SLC38基因家族的钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白（SNAT）现有11个家族成员[1]，根据他们的功能特点及调控类型不同可分为系统A和系统N[1-2].系统A转运体系包含3个亚型：SNAT1、SNAT2和SNAT4[2-3]，它们均转运小的脂肪族氨基酸，包括谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸等[3-5].其中SNAT2在哺乳动物组织中分布最为广泛[2，5-7].SNAT1、SNAT2和SNAT4介导的氨基酸跨膜转运均对酸敏感[2，8]，能被氨基酸类似物2-甲氨基异丁酸（MeAIB）所抑制[3，5，8]且在氨基酸饥饿刺激和激素刺激的情况下上调基因表达[3，9].系统A转运体系在1965年就已被发现，但这一转运系统的蛋白直到2000年才被鉴定出来[10].首先被鉴定出来的转运蛋白是SNAT1，接着SNAT2转运蛋白的基因被3个独立的科研团队分别克隆了出来[5，9-10].SNAT4是目前系统A中最晚被鉴定出来的转运蛋白.相比较系统A，系统N转运底物的范围相对较窄，系统N中的转运蛋白在协同转运氨基酸的同时还逆向共转运氢离子，而系统A转运蛋白则不能逆向转运氢离子[2，10].
SNAT2在哺乳动物组织中分布非常广泛.运用RNA杂交的方法在每个组织中均检测到了SNAT2 mRNA的存在，但体内试验没有检测出哺乳动物的脑组织中含有SNAT2蛋白.然而，用原位杂交的方法在脑组织中检测到了SNAT2 mRNA的存在，且在神经胶质细胞及血脑屏障中也检测到了SNAT2 mRNA[2].
SNAT2蛋白被推测是含有11次跨膜结构的膜蛋白[11]，存在着表达量低、分离纯化难度大及膜蛋白晶体难结晶等困难，至今SNAT2的晶体结构还没有被解析[12]，阻碍了人们对SNAT2及其家族蛋白的结构与功能的了解.目前，对于SNAT2的研究只能在酶学和细胞生物学的水平上进行.基于此原因，高效的SNAT2专一性抗体便成为不可缺少的工具.本研究针对制备SNAT2的抗体进行探索，并获得特异性较高的SNAT2多克隆抗体，为促进SNAT2蛋白的结构和功能方面的研究提供有效的材料.
1 材料与方法
1.1 材料、试剂
质粒pET28a（+）、pBK-CMV（Δ[1098-1300]）-SNAT2-HA（以下简写为pBK-CMV-Δ- SNAT2-HA） 和大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）为上海师范大学动物细胞与分子生物学实验室保存；人胚肾细胞（HEK293T/17，ATCC number CRL 11268） 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库.
各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自NEB；DNA胶回收试剂盒及小型质粒抽提试剂盒购自TIANGEN.DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司； Lipofectamine 2000购自Invitrogen 公司，蛋白酶抑制剂购自Roche公司，HA一抗购自上海中科英沐生物科技有限公司，二抗羊抗兔购自CST公司.常用的化学试剂为国产分析纯.本研究所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，杰李测序公司完成测序.
1.2 方 法
1.2.5 多克隆抗体的制备
由上海中科英沐科技有限公司制备多克隆抗体.简短地说，取1 mg纯化的SNAT2-75aa用1×PBS稀释后与完全弗氏佐剂（CFA）按1∶1混合使免疫原与佐剂形成稳定的乳剂.用该乳剂在新西兰大白兔的双肩周围皮下进行皮下注射及后大腿进行肌肉注射.每处注射量大约为总量的1/4.第一次免疫3周后，取0.5 mg的SNAT2-75aa用1×PBS稀释，然后与不完全弗氏佐剂（IFA）按1∶1混合形成稳定的乳剂，进行第二次注射.在第二次免疫3周后进行第三次免疫注射，方法与第二次相同.在第三次免疫注射1周后，在兔子耳动脉进行取血，室温过夜析出血清.
1.2.6 SNAT2多克隆抗体的亲和纯化
巯丙基琼脂糖凝胶6B （Thiopropyl sepharose ） 固定抗原亲和柱的制备：事先称取1 g冻干的粉末状柱料，放入15 mL塑料管中用蒸馏水浸泡过夜，使柱料膨胀，后用玻璃棒引流填入柱子中，避免产生气泡，用10个柱体积的平衡液（20mM Tris，pH7.5）平衡柱子.纯化SNAT2多克隆抗体：向亲和层析柱中加入1 mg纯化的SNAT2-75aa，使其与亲和柱反应1 h.用20 mmol/L pH 7.5 的Tris缓冲液洗涤未结合的蛋白.用Tris缓冲液调整血清pH 7.5再上层析柱.用5个柱体积的20 mmol/L pH 7.5 的Tris缓冲液洗去没有与抗原结合的抗体及杂蛋白后，再用5～10个柱体积的0.1 mol/L的pH 2.5的甘氨酸洗脱液，进行抗体的洗脱.收集含有抗体的洗脱液，通过紫外分光光度计测定收集抗体A280的吸光值计算抗体的浓度.
1.2.7 SNAT2多克隆抗体的蛋白免疫印迹鉴定和检测
用纯化前后的SNAT2-75aa蛋白进行抗体的检测，步骤如下：
制备12%的SDS-PAGE胶，每个胶孔SNAT2-75aa的上样量分别是2.58 ng，6.27 ng，15.68 ng，39.2 ng，78.4 ng，电泳停止后，转聚偏氟乙烯 （PVDF）膜.转膜结束后：①封闭，用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1 h；②一抗孵育：将纯化后的抗体用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释，稀释比为1∶500，室温孵育1.5 h；③洗膜：用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min；④二抗孵育：将羊抗兔二抗用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释，稀释比为1∶1500，室温孵育1 h；⑤洗膜：用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min；⑥暗室中用压X光片的方法进行显影.
收集pBK-CMV-Δ-SNAT2-HA质粒瞬时转染36 h的HEK293T细胞，用PBS洗涤3次，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPA 200 μL，4℃，3000 r/min离心，取上清液，用10% SDS-PAGE电泳分离，将凝胶中蛋白转移至PVDF 膜.分别用纯化后的SNAT2多克隆抗体（1∶1000）、抗HA多抗（Mouse Anti-HA 1∶2000）和羊抗鼠IgG二抗（1∶10000）孵育1 h，放射自显影.
2 结 果
2.3 SNAT2多克隆抗体的亲和纯化和蛋白免疫印迹检测
用制备的SNAT2多克隆抗体的血清检测免疫原蛋白SNAT2-75aa，结果如图4 （泳道1～5）.当SNAT2-75aa蛋白量降至39.2 ng时，含有SNAT2多克隆抗体的血清可以被检测到清晰狭窄的条带.为了进一步提高SNAT2多克隆抗体的质量和灵敏度，采用巯丙基琼脂糖凝胶6B （Thiopropyl sepharose ） 固定抗原亲和纯化的方法进一步对该抗体血清进行纯化，并利用SNAT2-75aa蛋白进行检测，结果见图4 （泳道6～10）.纯化后的SNAT2多克隆抗体可以检测到6.27 ng的SNAT2-75aa，条带清晰狭窄，表明纯化前后的SNAT2多克隆抗体检测灵敏度至少被提高了10倍.
为了检测制备的SNAT2多克隆抗体对SNAT2蛋白的特异性，瞬时转染pBK-CMV-Δ-SNAT2-HA到HEK293T细胞中，提取总蛋白进行蛋白免疫印迹检测.结果见图5.泳道1是用制备的SNAT2多克隆抗体检测的结果，泳道2是用HA单抗检测的结果.在SNAT2理论分子量为55kD的地方可以检测到清晰的条带，表明制备的SNAT2多克隆抗体具有高效的特异性.
3 讨 论
在中枢神经系统中，SNAT2主要转运谷氨酰胺进入细胞，介导谷氨酸-谷氨酰胺在大脑中的循环[13]，因此具有重要的生理功能.由于有效抗体的缺乏，目前人们对SNAT2蛋白在大脑中的分布和功能所知甚少.董晓云等将SNAT2的C端与标签蛋白HA连接，通过检测抗HA抗体检测SNAT2在细胞膜上的表达[14]；孟雯等将SNAT2的C端与报告基因EGFP连接，通过抗GFP抗体或检测荧光来测定SNAT2的表达与定位[15]，均获得了较好的效果.但若要检测内源性SNAT2表达和定位，上述带有标签或报告基因的SNAT2融合蛋白并不适用.目前市场上商业化的SNAT2的抗体一直存在着特异性不高、检测稳定性差等问题，不能很好地应用到实际研究中.
通过针对SNAT2 N端的75个氨基酸作为免疫原制备了抗SNAT2 的多克隆抗体.经过3次免疫注射新西兰大白兔获得的血清，经蛋白印迹检测SNAT2的效果并不理想（结果没有显示）.用巯丙基琼脂糖凝胶6B 固定抗原亲和纯化的方法对血清进一步纯化，用免疫原蛋白SNAT2-75aa检测，10 ng以下的蛋白可以被清晰地检测到，表明抗SNAT2抗体灵敏度增高.蛋白印迹检测SNAT2 在HEK293 T细胞中的表达，条带清晰、背景干净、结果稳定，表明抗SNAT2抗体的制备成功，为今后SNAT2的结构与功能研究提供了有效的工具.
参考文献：
[1] HAGGLUND M G，SREEDHARAN S，NILSSON V C，et al.Identification of SLC38A7 （SNAT7） protein as a glutamine transporter expressed in neurons[J].The Journal of Biological Chemistry，2011，286（23）：20500-20511.
[2] MACKENZIE B，ERICKSON J D.Sodiumcoupled neutral amino acid （System N/A） transporters of the SLC38 gene family[J].Pflugers Archiv：European Journal of Physiology，2004，447（5）：784-795.
[3] ZHANG Z，GREWER C.The sodiumcoupled neutral amino acid transporter SNAT2 mediates an anion leak conductance that is differentially inhibited by transported substrates[J].Biophysical Journal，2007，92（7）：2621-2632.
[4] ZHANG Z，PAPAGEORGIOU G，CORRIE J E，et al.Presteadystate currents in neutral amino acid transporters induced by photolysis of a new caged alanine derivative[J].Biochemistry，2007，46（12）：3872-3880.
[5] FRANCHIGAZZOLA R，DALL"ASTA V，SALA R，et al.The role of the neutral amino acid transporter SNAT2 in cell volume regulation[J].Acta Physiologica，2006，187（1-2）：273-283.
[6] ORTIZ V，ALEMAN G，ESCAMILLADELARENAL M，et al.Promoter characterization and role of CRE in the basal transcription of the rat SNAT2 gene[J].American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism，2011，300（6）：E1092-E1102.
[7] ZHANG Z，GAMEIRO A，GREWER C.Highly conserved asparagine 82 controls the interaction of Na+ with the sodiumcoupled neutral amino acid transporter SNAT2[J].The Journal of Biological Chemistry，2008，283（18）：12284-12292.
[8] EVANS K，NASIM Z，BROWN J，et al.Acidosissensing glutamine pump SNAT2 determines amino acid levels and mammalian target of rapamycin signalling to protein synthesis in L6 muscle cells[J].Journal of the American Society of Nephrology：JASN，2007，8（5）：1426-1436.
[9] PALII S S，CHEN H，KILBERG M S.Transcriptional control of the human sodiumcoupled neutral amino acid transporter system A gene by amino acid availability is mediated by an intronic element[J].The Journal of Biological Chemistry，2004，279（5）：3463-3471.
[10] SCHIOTH H B，ROSHANBIN S，HAGGLUND M G，et al.Evolutionary origin of amino acid transporter families SLC32，SLC36 and SLC38 and physiological，pathological and therapeutic aspects[J].Molecular Aspects of Medicine，2013，34（2-3）：571-585.
[11] YAO D，MACKENZIE B，MING H，et al.A novel system A isoform mediating Na+/neutral amino acid cotransport[J].The Journal of Biological Chemistry，2000，275（30）：22790-22797.
[12] SHI Q，PADMANABHAN R，VILLEGAS C J，et al.Membrane topological structure of neutral system N/A amino acid transporter 4 （SNAT4） protein[J].The Journal of Biological Chemistry，2011，286（44）：38086-30894.
[13] ZHANG Z，ALBERS T，FIUMERA H L，et al.A conserved Na（+） binding site of the sodiumcoupled neutral amino acid transporter 2 （SNAT2）[J].The Journal of Biological Chemistry，2009，284（37）：25314-25323.
[14] 董晓云，王函，孟雯，等.钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2-HA融合蛋白的构建及鉴定[J].上海师范大学学报：自然科学版，2012，41（1）：83-88.
[15] 孟雯，王函，董晓云，等.大鼠谷氨酰胺转运蛋白SNAT2-EGFP融合蛋白的表达与鉴定[J].中国细胞生物学学报，2011（11）：1248-1253.
Abstract：Sodiumdependent neutral amino acid transporter 2 （SNAT2），transport of small neutral amino acids，is the second member of the SLC38 family and widely expresses in mammals.SNAT2 dysfunction can lead to many neurological diseases，such as Alzheimer disease and Parkinson"s disease.In order to prepare SNAT2 special antibody，the gene of 75 amino acids of the N terminal of SNAT2 was amplied by PCR from pBK-CMVΔ-SNAT2-HA plasmid.The expression plasmid pET28a-SNAT2-75aa was constructed and transformed into BL21 （DE3）.SNAT2-75aa protein was induced to express by IPTG.After purification by Ni-column，the recombinant protein SNAT2-75aa was used to immunize New Zealand white rabbit in order to obtain SNAT2 polyclonal antibody.In order to further purify the antibody，Thiopropyl sepharose 6B column was used.Western blotting results show that the purified antibody can be used specially to detect SNAT2 transient expression in HEK293 cells.Successful preparation of SNAT2 polyclonal antibody will be benefit to further studying structure and function of SNAT2.
Key words：transporter； neutral amino acid； antibody； protein purification
（责任编辑：顾浩然）