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摘 要 克隆了野生木薯蔗糖合酶I基因的5′侧翼序列，发现其5′UTR区存在一个前导内含子，为了探究该基因启动子的调控区域以及前导内含子的可能功能，构建了6个侧翼序列梯度缺失载体并转化烟草。结果表明：野生木薯蔗糖合酶I基因的前导内含子可单独起始基因的转录，部分启动子序列的缺失会对基因的转录活性产生较大影响；不同缺失载体烟草转化株响应ABA的程度和方向存在差异，可能与ABA响应相关顺式作用元件的分布以及启动子序列与前导内含子的互作相关。该结果将会对木薯蔗糖合酶I基因的遗传改良提供理论指导。
关键词 蔗糖合酶；启动子；前导内含子；顺式作用元件
中图分类号 S533 文献标识码 A
Abstract The 5′ flanking sequence of sucrose synthase I gene was cloned in a wild cassava， and a leader intron in its 5′UTR. In order to explore the regulated domain of the promoter region and the possible function of leader intron， six deleted vectors were constructed and transformed into tobacco. The results showed that the leader intron of the wild cassava SuSy1 gene could start gene transcription by itself， and the sequence deletion in promoter had great influence on the transcription activity of SuSy1 gene. There were differences in magnitude and direction responding to ABA treatment among these transformed tobacco plants， it possibly caused by the distribution of ABA responsive cis-element， as well as the interactions between the regulated domains of promoter and the leader intron. In general， these results will provide theoretical guidance for genetic improvement of cassava SuSy1 gene.
Key words Sucrose synthase； Promoter； Leader intron；Cis-element
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.013
植物合成淀粉大都从分解光同化物蔗糖开始，并经过一系列的生化过程来合成淀粉。蔗糖合酶（SuSy）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是已知的2个在蔗糖向淀粉转化过程中起重要作用的限速酶，其中蔗糖合酶是开启蔗糖向淀粉转化的第一个酶，催化蔗糖+UDP←→果糖+UDPGlc的可逆反应，UDPGlc是淀粉合成的前体[1]，而且蔗糖合酶的活性可被蔗糖、缺氧和伤害诱导上调[2]。
蔗糖合酶在植物各组织中普遍存在，且在库器官中活性普遍较高[3]。在马铃薯中抑制蔗糖合酶基因的表达，其块茎中蔗糖含量无明显变化，但淀粉积累受到抑制且产量减少[4]，而过量表达SuSy4基因，蔗糖合酶活性显著增强，块茎中淀粉、ADPG 和UDPGlc 的含量增加，块茎产量提高[5]。此外，在玉米中增强蔗糖合酶的活性也同样可增加种子胚乳中的淀粉和ADPG含量[6]。由此可见，SuSy基因的表达丰度和酶活性可显著影响植物库器官吸收光同化物（尤其是蔗糖）的能力，而且蔗糖合酶是植物库器官淀粉生物合成的重要调节酶。
木薯是重要的产淀粉热带块根作物，也是中国热区燃料乙醇加工的主要原料。木薯SuSy1是目前已知在木薯块根中表达活性最高的蔗糖合酶基因家族成员[7]，本文克隆了野生木薯SuSy1基因的5′侧翼序列，构建梯度缺失启动子对5′侧翼序列中的调控区域进行鉴定，并对前导内含子的功能进行推测。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 本氏烟（Nicotiana benthamiana），由本实验室繁殖并保存；木薯栽培品种KU50，来自中国木薯种质资源圃（海南儋州）。
1.1.2 主要试剂 大肠杆菌菌株DH5a感受态由本实验室制备并保存。RNAplant植物RNA提取试剂（Tiangen），逆转录试剂盒（TaKaRa），琼脂糖凝胶回收试剂盒（Omega），限制性内切酶（ThermoFisher）均购自于海南光威公司，其它药品试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 野生木薯MeSuSyI基因5′侧翼序列的克隆与分析 在木薯基因组数据库（http：//phytozome.jgi.doe.gov）获取cassava4.1_001871m（MeSuSyI）部分编码序列及其5′端共计约3 000 bp，并以此序列利用Primer-BLAST程序设计引物SSP1和SSP2（表1）。以野生木薯W14的基因组DNA为模板得到特异PCR产物，经回收、克隆至PMD18-T载体。利用顺式作用元件分析软件PLACE[8]和PlantCARE[9]，对获得的5′侧翼序列进行顺式作用元件预测。
1.2.2 转基因载体的构建与遗传转化 MeSuSyI基因5′侧翼序列的梯度缺失依次为-1027U1IU2（转录起始位点为+1，-1027表示转录起始位点前1 027 bp，U1表示前导内含子前54 bp UTR，I表示前导内含子，U2表示前导内含子后20 bp UTR），-876U1IU2，-651U1IU2，309U1IU2，U1IU2和-1027，并利用引物组合SSP1027、SSP876、SSP651、SSP309、SSPU1和SSPR1，及SSP1027和SSPR2以野生木薯基因组DNA为模板进行PCR扩增（表1）。将上述特异PCR产物纯化、酶切后连接到pCAMBIA1301转化载体上，替换原来的CaMV35S 启动子驱动GUS基因的表达，得到的梯度缺失转化载体依次命名为pE1027U1IU2：：GUS， pE876U1IU2：：GUS， pE651U1IU2：：GUS， pE309U1IU2：：GUS， pEU1IU2：：GUS and pE1027：：GUS。这6个转化载体利用农杆菌（EHA105）介导的方法转化本生烟草（Nicotiana benthamiana）获得阳性转化芽。
1.2.3 植物材料的培养与处理 所有转基因阳性芽在潮霉素浓度为25 mg/L的MS培养基上生长，16 h光照8 h黑暗，环境温度26 ℃。3周后选取根系发达的粗壮植株置于室内常温炼苗，6～7 d后开盖并加入少量水浸泡2 h，剪去黄化叶并洗掉根系上的培养基，移栽到花盆中（营养土v ∶ 椰糠v=1 ∶ 1）覆膜保湿，7 d后揭膜置于温室生长，据其长势施用少许肥料，并适时收取T1代本氏烟转基因种子。
取T1代种子，70%酒精和2.5%次氯酸钠溶液消毒后，播于潮霉素MS固体培养基培养，16 h光照8 h黑暗15 d后，取正常生长种子苗，一部分用于GUS蛋白组织染色，另一部分转移到MS固体培养瓶继续生长，待苗龄45～60 d时选取长势良好的植株直接取样，或ABA处理后取样用于GUS蛋白酶活性定量检测。
ABA处理：每个培养瓶中加入1.0 mL浓度为100 μmol/L的ABA溶液，使其均匀覆盖于培养基表面，后置于以前的光照环境中1.5 h，取转基因本氏烟植株展开叶液氮速冻。对照和ABA处理的每个转化载体均取样3株混合为一个实验样品，-80 ℃冰箱保存备用。
1.2.4 转基因植株的组织化学染色和GUS酶活定量检测 取4叶期左右的转基因烟草无菌苗，浸入X-Gluc染色液（GBT， St. Louis， USA），置于37 ℃温浴过夜，显色后酒精脱色并拍照。GUS酶活定量检测参照 Jefferson等[10]和Zhu等[11]的方法进行。
2 结果与分析
2.1 野生木薯SuSy1基因5′侧翼序列的克隆与分析
木薯SuSy1基因（cassava4.1_001871m）是其家族在贮藏器官中表达活性最高的成员，根据网站http：//phytozome.jgi.doe.gov中木薯品种AM560基因组草图提供的5′侧翼序列信息设计引物，以野生木薯基因组DNA为模板，PCR扩增获得了约2.1 kb的DNA序列。克隆并测序后，获得野生木薯SuSy1基因ATG上游2 146 bp序列，进一步分析发现，野生木薯SuSy1基因的5′侧翼序列中有1个1 042 bp的前导内含子（Leader Intron， 图1）。启动子区的TATA box，CAAT box等关键元件和其它顺式作用元件的分布详见表2。
2.2 野生木薯SuSy1基因启动子调控区间的筛选
在进行GUS酶活测定前，首先获得了植物总蛋白浓度测定的标准曲线：Ya=20.936Xa-13.285，R2=0.997 9，Ya为蛋白质浓度（mg/mL），和4-MU荧光标准曲线：Yb=0.474 3Xb-64.568，R2=0.999 1，Yb为4-MU的量（nmol）。参考前人的GUS酶活检测方法，对梯度缺失启动子启动GUS基因的活性进行了定量测定，发现在6个梯度缺失载体转化苗中，pE876U1IU2：：GUS和pEU1IU2：：GUS植株的GUS酶活明显高于其它转化植株，由此可知，野生木薯SuSy1基因的前导内含子具有启动活性，可以直接起始基因的转录；-1027至-877区间的151 bp序列对启动子活性有较强的抑制作用；-876至-652区间的225 bp序列可极大地提高启动子的转录活性；SuSy1基因的启动子与前导内含子组合起来的启动活性低于前导内含子单独驱动的启动活性（图2～3）。
2.3 野生木薯SuSy1基因启动子对ABA的响应
转化植株脱落酸（ABA）处理1.5 h后，取上部叶片测定GUS酶活，发现6个梯度缺失载体转化苗中，pE1027U1IU2：：GUS和pE651U1IU2：：GUS植株GUS酶活极显著上调，pE876U1IU2：：GUS、pEU1IU2：：GUS和pE1027：：GUS植株GUS酶活极显著或显著下调（图3）。由此可知，p1027U1IU2与p1027和pU1IU2响应ABA处理的方向相反，p1027U1IU2上调，而p1027和pU1IU2下调；ABA处理条件下，p876U1IU2下调GUS基因的表达，预示-1027至-876区间的151 bp序列正向响应ABA处理，可能存在ABA结合顺式作用元件；p651U1IU2活性上调，而p309U1IU2 ABA处理前后差异不显著，表示-876至-652区间225 bp序列负响应ABA处理，而-651至-310区间的342 bp序列对ABA无明显的响应；p1027和pU1IU2在ABA处理下，启动活性均呈下调趋势，而p1027U1IU2和p651U1IU2上调，说明启动子区的部分序列需要与前导内含子一起形成特定的二级结构才能正向响应ABA，且这部分序列应该是-1027至-876区间和-651至-309区间。
3 讨论与结论
本研究克隆了野生木薯SuSy1基因的5′侧翼序列，发现在其5′UTR区存在1个前导内含子，而且该内含子具有启动活性，可单独起始GUS基因的转录；p876U1IU2启动活性较高，若需要提高SuSy1基因转录活性并保持其组织特异性，可使用p876U1IU2为启动序列。野生木薯SuSy1基因5′侧翼梯度缺失启动子对ABA处理响应明显，可能与启动子中分布有较多ABA响应顺式作用元件有关，如-1027至-877区间存在3个MYB元件，-876至
-652区间存在4个MYB元件和1个W-box，-651至-310区间存在3个MYB元件和2个W-box（表2）。另外，整个启动子区广泛分布根特异表达元件ROOTMOTIFTAPOX1，与SuSy1基因在块根中转录活性高具有一致性[7]。
前导内含子在调控基因转录活性上功能多样，如微管蛋白基因（Ostub16）的前导内含子是维持其高转录活性所必需的[12]，马铃薯SuSy3基因失去前导内含子会导致转录活性丧失，马铃薯SuSy4基因的前导内含子缺失会对该基因的组织特异性和转录活性产生较大影响[13-14]，另有拟南芥COX5c和MHX基因的前导内含子既可提高该基因的转录活性，还可促进基因mRNA翻译为蛋白质[15-16]。本研究中野生木薯SuSy1基因的前导内含子缺失后，对基因转录活性影响不大，但前导内含子自身的启动活性很高，比其他梯度缺失启动子都要高，包括p1027。由此推测，野生木薯SuSy1基因的前导内含子并不是维持基因转录活性所必需的，它的功能可能与环境胁迫和激素处理条件下的基因转录调控相关，主要表现形式可能是启动子中的特定序列可与前导内含子形成特定的二级结构来影响基因的转录，但究竟以何种形式进行转录调控还需进一步研究。
参考文献
[1] Geigenberger P. Regulation of sucrose to starch conversion in growing potato tubers[J]. J Exp Bot， 2003， 54（382）： 457-465.
[2] Zeng Y Y， Avigne W T， Koch K E. Differential regulation of sugar-sensitive sucrose synthases by hypoxia and anoxia indicate complementary transcriptional and posttranscriptional responses[J]. Plant Physiol， 1998， 116（4）： 1 573-1 583.
[3] Sung S J， Xu D P， Black C C. Identification of actively filling sucrose sinks[J]. Plant Physiol， 1989， 89： 1 117-1 121.
[4] Zrenner R， Salanoubat M， Willmitzer L， Sonnewald U. Evidence of the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants（Solanum tuberosum L.）[J]. Plant J， 1995， 7： 97-107.
[5] Baroja-Fernández E， MuNoz F J， Montero M， et al. Enhancing sucrose synthase activity in transgenic potato（Solanum tuberosum L.）tubers results in increased levels of starch， ADPglucose and UDPglucose and total yield[J]. Plant Cell Physiol， 2009， 50（9）： 1 651-1 662.
[6] Li J， Baroja-Fernández E， Bahaji A， et al. Enhancing sucrose synthase activity results in increased levels of starch and ADP-glucose in maize（Zea mays L.）seed endosperms[J]. Plant Cell Physiol， 2013， 54（2）： 282-294.
[7] 方开星. 木薯SuSy1和SuSy4基因克隆及SuSy1启动子核心区间的确定[D]. 海口： 海南大学， 2014.
[8] Higo K， Ugawa Y， Iwamoto M， et al. Plant cis-acting regulatory DNA elements（PLACE）database[J]. Nucle Acid Res， 1999， 27（297）： 300.
[9] Lescot M， Dehais P， Thijs G， et al. PlantCARE， a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J]. Nucle Acid Res， 2002， 30（325）： e327.
[10] Jefferson R A， Kavanagh T A， Bevan M W. GUS fusions： beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. EMBO J， 1987， 6： 3907.
[11] Zhu Q， Song B， Zhang C， et al. Construction and functional characteristics of tuber-specific and cold-inducible chimeric promoters in potato[J]. Plant Cell Rep， 2008， 27（47）： 55.
[12] Morello L， Bardini M， Sala F， et al. A long leader intron of the Ostub16 rice beta-tubulin gene is required for high-level gene expression and can autonomously promote transcription both in vivo and in vitro[J]. Plant J， 2002， 29（1）： 33-44.
[13] Fu H Y， Kim S Y， Park W D. A potato Sus3 sucrose synthase gene contains a context-dependent 3′ element and a leader intron with both positive and negative tissue-specific effects[J]. Plant Cell， 1995， 7： 1 395-1 403.
[14] Fu H Y， Kim S Y， and Park W D. High-leve1 tuber expression and sucrose inducibility of a potato Sus4 sucrose synthase gene require 5′ and 3′ flanking sequences and the leader lntron[J]. Plant Cell， 1995， 7： 1 387-1 394.
[15] Curi G C， Chan R L， Gonzalez D H. The leader intron of Arabidopsis thaliana genes encoding cytochrome c oxidase subunit 5c promotes high-level expression by increasing transcript abundance and translation efficiency[J]. J Exp Bot， 2005， 56（419）： 2 563-2 571.
[16] Akua T， Shaul O. The Arabidopsis thaliana MHX gene includes an intronic element that boosts translation when localized in a 5′UTR intron[J]. J Exp Bot， 2013， 64（14）： 4 255-4 270.