摘 要：ZDC-01菌株为分离自海洋、对保护地蔬菜土传病害具有较好防治效果的地下芽孢杆菌（Bacillus subterraneus）。为了提高菌株ZDC-01的活菌数，该研究通过单因子水平筛选和正交试验法对活性菌株ZDC-01的发酵培养基配方和摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明，菌株ZDC-01的最佳培养基组成为可溶性淀粉2.0%，豆饼粉3.0%，葡萄糖0.5%，鱼粉0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4·7H2O 0.03%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.3%。最适发酵条件为培养温度30℃、摇床转速200 r/min、发酵起始pH 7.0、接菌量3%、装液量50mL/250mL、发酵时间48h。经验证，优化后发酵菌液活菌数为38×109cfu/mL，与初始发酵工艺的发酵菌液含菌量（23×109cfu/mL）相比，提高了65.22%。
关键词：地下芽孢杆菌；生防菌株ZDC-01；活菌數；正交试验
中图分类号 TQ920 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）21-0032-05
Optimization of Fermentation Medium Components and Cultural Conditions for Marine Bacillus subterraneus ZDC-01 in Flask
Fan Jianlong et al.
（Qingdao Zhongda Biotech Co.Ltd.，Qingdao 266122，China）
Abstract：Bacillus subterraneus ZDC-01，originally isolated from the marine，showed strong biocontrol activities against a large number of soil-borne diseases of protected vegetable.This paper reports the fermentation medium and the culture conditions of strain ZDC-01 optimized by single factor horizontal and orthogonal experiments.The results showed that the best medium were Soluble starch 2.0%，soybean cake powder 3.0%，glucose 0.5%，fish meal 0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4.7H2O 0.03%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.3%.The optimal fermentation conditions were：culture temperature 30℃，rotation speed 200 r/min，initial pH value 7.0，inoculation 3%，liquid volume of 50mL/250mL，and fermentation for 48 h.Optimized biological fermentation process resulted in fermentation efficiency 38×109cfu/mL，increased by 65.22% in comparison with the initial fermentation process（23×109cfu/mL）.
Key words：Bacillus subterraneus；Bio-control strain；Viable count；Orthogonal experiments
植物病虫害一直是农业生产的大敌，目前我国主要以化学农药防治为主，长期大量施用对生态环境和我们人类都造成严重危害。随着生物防治植物病害研究的深入，这种对环境友好、人畜无害、可降低化学农药的使用的防治方法，得到了社会越来越多的关注和认可。芽孢杆菌以其耐热抗逆、环境友好等诸多优点，成为了近年生物防治的热点[1]。其产生的多种抗菌活性物质如脂肽类抗生素、抗菌蛋白或多肽类化合物对大多植物病原真菌都表现出很强的抑菌活性，且芽孢杆菌内生芽孢抗逆性强，繁殖速度快，有利于工业化生产，在农牧业中具有良好的开发应用前景[2-5]。目前，用于防治植物病害的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、侧孢芽孢杆菌（B.laterosporus）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、短小芽孢杆菌（B.pumilus）等[6-7]。随着生物防治研究的不断深入，从陆生资源中分离筛选出新的有效生防菌越来越难，探索新的生防资源迫在眉睫。而海洋微生物资源丰富、种类繁多，独特的海洋生态环境（高盐、高压、缺氧等）为微生物独特的代谢途径提供了可能，从而产生大量复杂多样、具有较强生物活性和结构新颖的活性物质，在抗菌、抗肿瘤以及环境治理方面有重要的意义[8-10]。目前，对于海洋活性菌株的报道也越来越多，陈香等[11]鉴定了一株海洋短小枯草芽孢杆菌，并对其生长条件和抑菌活性进行了研究；张君等[12]报道了对海洋芽孢杆菌B-9987中抗MDR菌活性成分的研究；石灵芳[13]等对海洋枯草芽孢杆菌UMBR1027产抑金黄色葡萄球菌活性蛋白分离鉴定以及发酵条件进行优化。
本实验室从合作单位中国科学院海洋研究所获得的海洋细菌中经过筛选得到的一株拮抗地下芽孢杆菌B.subterraneus ZDC-01，该菌株具有广谱抗菌活性对茄子灰霉病菌、白菜黑斑病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、苹果轮纹病菌和柑橘炭疽病菌等植物病原真菌均有较强的抑菌活性（另文发表），表现出良好的生防应用开发前景。地下芽孢杆菌ZDC-01已获得国家发明专利：一株地下芽孢杆菌制备方法及其应用（专利号：201610395357.3）。采用单因子和正交试验设计对该菌株的摇瓶培养基和发酵条件进行优化，旨在提高其发酵活菌数量为该菌株微生物菌剂的开发和应用，提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种 菌种ZDC-01，是由本实验室从中国科学院海洋研究所提供的海洋细菌中筛选得到，通过生理生化试验和16S rRNA基因序列分析确定为地下芽孢杆菌，菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号：CGMCC No.12216）。
1.1.2 培养基（1）固体种子培养基：蛋白胨1.0%，酵母浸粉1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2%；（2）液体种子培养基：其组成除不加琼脂粉外，其他成分同固体种子培养基；（3）初始发酵培养基：可溶性淀粉3.0%，豆饼粉2.0%，葡萄糖0.5%，鱼粉0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4.7H2O 0.02%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.1%。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化 将保存的菌种转接到斜面种子培养基，30℃，培养24h，备用。
1.2.2 种子液的制备 取一环活化的菌种，接入装量为50mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃，160r/min培养24h，备用。
1.2.3 摇瓶培养 分别取2mL种子液接入盛有100mL初始发酵培养基的250mL三角瓶中（接种量为2%，v/v），pH调至7.0，30℃，160r/min振荡培养48h，进行单因素和正交试验的发酵培养基和条件研究。
1.2.4 测定方法 活菌数测定：采用平板计数法[14]。
1.2.5 发酵培养基单因子筛选（1）可溶性淀粉：在初始培养基的基础上，固定其他因子，依次改变可溶性淀粉的量为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。培养基pH调至7.0，取种子液2mL移至装液量为100mL/250mL的各个发酵培养基中，30℃、160r/min振荡培养48h后，采用稀释平板法统计活菌数。初始培养基作对照，每个处理重复3次。（2）豆饼粉：在初始培养基的基础上，固定其他因子，依次改变豆饼粉的量为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。以下步骤同可溶性淀粉。（3）MgSO4·7H2O：在初始培养基的基础上，固定其他因子，依次改变MgSO4.7H2O的量为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%。以下步骤同可溶性淀粉。
1.2.6 发酵条件单因子筛选 采用最适培养基配方，对菌株ZDC-01的接菌量、温度、转速、起始pH值及装液量等发酵条件继续进行优化。发酵基本条件为250mL三角瓶装入100mL最适培养基，接种量2%，pH调至7.0，30℃，160r/min摇床恒温振荡培养48h，每处理重复3次，初始培养条件作对照，优化1个因素时其他条件保持不变。接菌量分别按照1%、2%、3%、5%、8%的体积百分数；发酵温度分别设为25、28、30、37、42℃；转速分别为160、180、200、220r/min；培养基起始pH分别调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；在250mL的三角瓶中分别装入25、50、75、100mL发酵培养基优化装液量。
1.2.7 正交试验设计 首先采用单因子试验，在以上单因子试验发酵培养基优化中得到的可溶性淀粉（A）、豆饼粉（B）、MgSO4.7H2O（C）进行3因素3水平的正交试验。发酵条件优化中得到的温度（A）、转速（B）、装液量（C），进行3因素3水平的正交试验。采用L9（33）正交表（表1）确定各因子的最佳组合。
2 结果与分析
2.1 发酵培养基单因子筛选 当可溶性淀粉含量为2.0%、3.0%、4.0%时，测得活菌数较多（图1）；当豆饼粉含量为2.0%、3.0%、4.0%时，测得活菌数较多（图2）；当MgSO4·7H2O的量为0.02%、0.03%、0.04%时，测得活菌数较多（图3）。因此，选择可溶性淀粉含量为2.0%、3.0%、4.0%，豆饼粉含量为2.0%、3.0%、4.0%，MgSO4·7H2O的量为0.02%、0.03%、0.04%这9个处理进行正交试验。
2.3 正交试验优化发酵培养基和条件
2.3.1 发酵培养基优化结果及分析 试验方案设计及结果见表2。由表2的极差分析结果可知，各因素对菌株ZDC-01的活菌数的影响的主次顺序为豆饼粉（因素B）>可溶性淀粉（因素A）>MgSO4·7H2O（因素C），通过直观分析得到最佳组合为A3B3C1，即可溶性淀粉4.0%，豆饼粉4.0%，MgSO4·7H2O 0.02%。
2.3.2 發酵条件优化结果及分析 试验方案设计及结果见表4。由表4的极差分析结果可知，各因素对菌株ZDC-01活菌数影响的主次顺序为装液量（因素C）>转速（因素B）>温度（因素A），通过直观分析得到最佳组合为A2B2C3，即温度30℃、转速180r/min、装液量100mL/250mL。
2.3.3 生长曲线 地下芽孢杆菌ZDC-01的生长曲线如图9所示。由图9可知，发酵开始后的12～30h，菌株处于对数生长期，活菌数迅速增多；之后曲线平稳，进入稳定期；在培养的后期，菌株开始出现衰亡，部分菌株开始自溶；发酵培养到48h，达到生长最佳期，有效活菌数量达到38×109cfu/mL。因此，最佳发酵培养时间控制在48h较为合理。
2.4 验证试验 摇瓶培养基及发酵条件优化后有效活菌数为38×109cfu/mL，优化前的有效活菌数为23×109cfu/mL，优化率为65.22%。经过单因子筛选和正交试验优化后，菌株ZDC-01的有效活菌数明显提升，优化效率显著。
3 讨论与结论
芽孢杆菌作为生防菌，具有对人畜无害、不污染环境且其繁殖能力强、易于工业化生产等特点，其在生物肥料和生物农药开发领域具有十分广阔的应用前景。芽孢杆菌能够产生多种脂肽类抗菌物质[15-17]，其代谢产物的产生主要受培养基的成分、发酵条件以及复杂的代谢调节机制的综合影响[18]。不同培养基的营养成分和发酵条件可显著影响菌株代谢物质的产量及生长[19]。（下转93页）（上接35页）目前，微生物农药大多是以活菌制剂为主，发酵工艺不稳定和活菌数不高是研究和生产中常见问题，因此生防菌株的发酵生产工艺是决定其能否被开发为生物农药的关键[20]。
发酵工艺的优化是微生物发酵产品成功实现产业化的重要环节，本试验通过使用单因子试验法和正交试验法对地下芽孢杆菌ZDC-01发酵培养基和发酵条件进行了优化，以期获得菌株ZDC-01的最佳发酵工艺，大幅度提高其生物发酵效率，为产业化发酵生产及大面积推广地下芽孢杆菌微生物菌剂提供理论依据。以活菌数为指标，最终确定了菌株ZDC-01的最佳发酵培养基为可溶性淀粉2.0%，豆饼粉3.0%，葡萄糖0.5%，鱼粉0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4·7H2O 0.03%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.3%，最佳发酵条件为培养时间48h，接菌量3%，温度30℃、起始pH为7.0、转速200r/min、装液量50mL/250mL，优化后发酵液中的活菌数较优化前提高65.22%，优化效率十分显著。
本研究对地下芽孢杆菌ZDC-01的培养基组成及培养条件仅进行了摇瓶发酵的初步研究，接下来需要进一步通过发酵罐放大试验来验证确定的发酵参数，从而更好地为其工业发酵并将该菌株用于植物病害的生物防治提供理论依据。
参考文献
[1]张立钦，吴甘霖.农业生态环境污染防治与生物修复[M].北京：中国环境科学出版社，2005.
[2]向亚萍，陈志谊，罗楚平，等.芽孢杆菌的抑菌活性与其产脂肽类抗生素的相关性[J].中国农业科学，2015，48（20）：4064-4076.
[3]王全，王占利，高同国，等.响应面法对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）12-7产抗菌蛋白条件的优化[J].棉花学报，2016，28（3）：283-290.
[4]王宏鹏，楼坚，陈丽春，等.芽孢杆菌HZ-16发酵产物中的环二肽类化学成分[J].天然产物研究与开发，2017，29（5）：783-786.
[5]权春善，王军华，徐洪涛，等.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的初步研究[J].微生物学报，2006，46（1）：7-12.
[6]WICHITRA L，PUNPEN H，SAMERCHAI C.Growth inhibitory properties of Bacillus subtilis strains and their metabolites against the green mold pathogen（Penicillium digitatum Sacc.）of citrus fruit[J].Postharvest Biology and Technology，2008，48（1）：113-121.
[7]SWAIN M R，RAY R C.Biocontrol and other beneficial activities of Bacillus subtilis isolated from cow dung microflora[J].Biosci Biotechnol Biochem，2009，164：121-130.
[8]牛燕燕，郑彩娟.产生物活性物质的海洋微生物研究概况[J].广州化工，2013（10）：1-2+5.
[9]Prasanna，Habbu，jayanand，et al.Antimicrobial metabolites from marine microorganisms[J].中国天然药物，2016（2）：101-116.
[10]关星叶，李红权，肖勤.海洋天然活性物质的药用研究进展[J].承德医学院学报，2017，34（4）：332-336.
[11]陈香，唐彤彤，孙星，等.海洋短小枯草芽孢杆菌的鉴定及抑菌活性分析[J].微生物学杂志，2017，37（1）：7-13.
[12]张君，任鹏飞，田黎，等.海洋芽孢杆菌B-9987中抗MDR菌活性成分研究[J].中国海洋药物，2016，（5）：45-49.
[13]石灵芳，姜明国，吴家法，等.海洋枯草芽孢桿菌UMBR1027产抑金黄色葡萄球菌活性蛋白分离鉴定及发酵条件进行优化[J].农业生物技术学报，2016，24（9）：1354-1363.
[14]沈萍，陈向东.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2007：28-34.
[15]益生芽孢杆菌脂肽类抑菌成分的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析[J].动物营养学报，2017，29（4）：1191-1197.
[16]基于NRPS基因筛选鉴定产生环脂肽葡萄附生细菌的研究[J].食品工业科技，2017（12）：164-170.
[17]芽孢杆菌脂肽类抗生素的研究进展[J].湖北农业科学，2015，54（12）：2817-2820.
[18]马桂珍，葛正华，刘兆善，等.海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1培养基及摇瓶发酵条件优化[J].作物杂志，2013（3）：36-41.
[19]Rahman M S，Ano T，Shoda M.Second stage production of iturin A by induced germination of Bacillus subtilis RB14[J].Journal of Biotechnology，2006，125（4）：513-515.
[20]郭龙涛，邱思鑫，蔡学清，等.内生解淀粉芽孢杆菌TB2 液体发酵条件的研究[J].热带作物学报，2010，31（2）：259-264.
（责编：张宏民）